農(nóng)桿菌介導(dǎo)不育基因轉(zhuǎn)化懸鈴木及長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)植株的遺傳穩(wěn)定性分析的研究.pdf

1、懸鈴木因其眾多優(yōu)點(diǎn)在園林綠化中廣泛應(yīng)用，并享有“行道樹之王”的美稱。但是，懸鈴木的花粉、種毛等問題不僅污染環(huán)境，還容易誘發(fā)各種呼吸性和過敏性疾病，從而限制了它的進(jìn)一步應(yīng)用。植物基因工程的快速發(fā)展，尤其是創(chuàng)造不育的基因工程在植物中的應(yīng)用，為無球果懸鈴木的培育開辟了嶄新的途徑。 本課題組在懸鈴木無果育種上已經(jīng)進(jìn)行了多年的研究，并已經(jīng)建立了高效的懸鈴木葉片再生體系以及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系。本研究在此基礎(chǔ)上對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化體系中其他關(guān)

2、鍵因子進(jìn)行摸索與確定，初步建立了優(yōu)化的轉(zhuǎn)化模式，并通過優(yōu)化的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將導(dǎo)致雄性不育的核糖核酸酶基因(barnase)導(dǎo)入到懸鈴木中，并由PCR檢測(cè)結(jié)果表明已經(jīng)獲得了轉(zhuǎn)入不育基因的轉(zhuǎn)基因植株。另外，通過簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間(ISSR)分子標(biāo)記體系來分析評(píng)價(jià)懸鈴木長(zhǎng)期離體培養(yǎng)植株的遺傳穩(wěn)定性，為特定基因型的轉(zhuǎn)化受體材料是否發(fā)生體細(xì)胞變異提供早期分子監(jiān)控信息，輔助懸鈴木遺傳改良的順利進(jìn)行。主要研究結(jié)果如下： 1．通過GUS基因

3、瞬間表達(dá)來摸索和確定農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系中的其它關(guān)鍵影響因子，包括根癌農(nóng)桿菌菌株、表面活性劑、細(xì)菌浸染液和共培養(yǎng)中蔗糖濃度，初步建立了優(yōu)化的遺傳轉(zhuǎn)化體系。研究結(jié)果表明：根癌農(nóng)桿菌菌株為EHAl05，浸染液中添加0．01％的表面活性劑Tween-20，使用MS液體培養(yǎng)基附加3％蔗糖作為細(xì)菌懸浮液，結(jié)合共培養(yǎng)基中蔗糖濃度為1．5％或3％可以得到最佳組合，其GUS瞬間表達(dá)率可高達(dá)100％。 2．通過優(yōu)化的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化模式，

4、將均含有目的基因核糖核酸基因(6arnase)的兩個(gè)不同的雙元表達(dá)載體(pBI-FBSBA：R/bamase和PTBS/bamase)導(dǎo)入到懸鈴木中，最后分別得到轉(zhuǎn)入pBI-TBSBAR/bamase基因的轉(zhuǎn)化植株4棵，轉(zhuǎn)入PTBS/barnase基因的轉(zhuǎn)化植株5棵，經(jīng)PCR初步鑒定9棵轉(zhuǎn)化植株均為陽性，表明不育基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入到懸鈴木基因組中。通過優(yōu)化的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法可以得到5％的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化率。 3．隨機(jī)選取20個(gè)來自同一

5、克隆系的快繁苗作為試驗(yàn)材料來分析評(píng)價(jià)長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)植株的遺傳穩(wěn)定性。研究結(jié)果表明：從38條ISSR引物中篩選得到16條引物可以產(chǎn)生明亮清晰、重復(fù)性高的條帶，條帶總數(shù)為103條，其中86條條帶表現(xiàn)為一致性，在20個(gè)快繁苗中無任何差異；而剩下的17條條帶表現(xiàn)為多態(tài)性(多態(tài)率16.5％)。對(duì)于20個(gè)試驗(yàn)群體來說，一共得到1，771條明亮清晰的條帶，其中僅僅有5 1條條帶表現(xiàn)為多態(tài)性，整個(gè)試驗(yàn)群體的總多態(tài)率為2.88％。 4.基于ISSR

6、條帶統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，運(yùn)用相關(guān)軟件進(jìn)行了相似系數(shù)的分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。研究結(jié)果表明：20個(gè)懸鈴木快繁苗之間的相似系數(shù)在0.92到1.00之間波動(dòng)，在91％的相似水平可以將20個(gè)快繁苗聚為一個(gè)大類，而在95％的相似水平可以將其劃分為四個(gè)類群。如此之高的相似系數(shù)和如此之低的遺傳變異率(多態(tài)率)對(duì)于體外培養(yǎng)8年之久的懸鈴木快繁苗來說，在很大程度上被認(rèn)定是遺傳相對(duì)穩(wěn)定的。研究結(jié)果也證實(shí)了腋芽分支繁殖是一種比較安全的快繁方式，在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)可以保持