水貂綠膿肝菌fliC基因表達及其對小鼠免疫效力的研究.pdf

1、綠膿桿菌可以引起人和多種動物感染發(fā)病，是一種危害人類健康及畜牧業(yè)發(fā)展的重要條件致病菌。一直以來，人們希望能找出預防和控制該菌感染的有效方法。近年來發(fā)現綠膿桿菌具有廣譜耐藥性，其對大多數防腐劑和抗菌藥物表現為天然或獲得性多重耐藥，所致感染可供選擇的有效抗菌藥物越來越少，使臨床治療的難度不斷增加。此外綠膿桿菌血清型眾多，不同血清型菌株其免疫原性不盡相同，給綠膿桿菌疫苗的研制帶來很大困難。有實驗證明f(l)iC基因是所有綠膿桿菌共同具有的基因

2、，其編碼的鞭毛蛋白是重要的表面抗原，具有種屬特異性，且不同血清型之間具有相同的鞭毛蛋白免疫原，能產生交叉保護作用。鑒于綠膿桿菌感染的普遍性，以及鞭毛基因的特點，本研究克隆和表達f(l)iC基因，并結合小鼠免疫模型分析其免疫原性，探討綠膿桿菌鞭毛蛋白疫苗對于綠膿桿菌感染的保護作用，對構建綠膿桿菌f(l)iC基因工程疫苗和從根本上防止綠膿桿菌的感染具有重要意義。
　　 首先對山東地區(qū)分離的不同來源綠膿桿菌進行鞭毛抗原基因分型，以確定

3、貂源綠膿桿菌的主要流行血清型。分析比較GenBank登錄的綠膿桿菌f(l)iC基因序列，根據保守區(qū)域設計分型引物，以提取的細菌基因組DNA為模板，擴增f(l)iC基因的部分片段，根據片段大小確定鞭毛類型（A型或B型），對兩種類型代表株的擴增產物進行測序分析，驗證PCR分型方法的可靠性，最終得出山東地區(qū)貂源綠膿桿菌的流行血清型為H抗原基因A型。
　　 其次對兩種類型代表株f(l)iC全基因進行克隆與序列分析。根據Genbank登錄

4、的A型和B型f(l)iC基因序列分別設計引物，在引物的上下游分別引入酶切住點BamHⅠ和XhoⅠ，擴增兩種鞭毛類型代表株PASD01和PASD03的f(l)iC(A型fliC1185bp、B型fliC1467bp)全基因，按常規(guī)方法克隆到pMD18-T載體，制備重組質粒，然后導入大腸桿菌DH5α中，用藍白斑實驗初步篩選可疑陽性克隆?？梢申栃钥寺∵M一步進行特異PCR和酶切鑒定后對插入片段進行測序，并將測序的序列與已知序列進行同源性比較。<

5、br>　　 最后對A型鞭毛菌f(l)iC基因進行原核表達，并初步分析其免疫原性及免疫保護性。將測序鑒定正確的A型f(l)iC基因從pMD18-T-fliCA陽性克隆中純化、回收，與表達載體pGEX-6P-1連接，并轉化大腸桿菌DH5α中，得到基因工程菌，經酶切和測序鑒定正確的陽性克隆命名為pGEX-6P-1-f(l)iCA。將重組表達質粒轉入大腸桿菌BL21(DE3)中進行IPTG誘導表達，表達產物進行SDS-PAGE與Western