胸膜肺炎放線桿菌菌影（Ghost）的制備及其免疫效力評價.pdf

1、本實驗通過PCR技術擴增噬菌體PhiX174的溶菌基因E，將該基因連接到含有λPL/PR-cI857啟動阻遏系統(tǒng)的pBV220載體中，從而使溶菌基因E和啟動阻遏系統(tǒng)λPL/PR-C1857串聯(lián)成為溫度敏感的溶菌盒E-λPL/PR-C1857，構建重組質(zhì)粒pBV-E。再將含有E基因的溶菌盒插入到App-E.coli穿梭載體pGZRS-18中，成功地構建App-E.coli穿梭溶菌質(zhì)粒pGZRS-Eλ。采用電擊穿孔法將其轉(zhuǎn)入胸膜肺炎放線桿菌

2、APP1型shope4074菌株中，含有裂解質(zhì)粒的胸膜肺炎放線桿菌在280c條件下生長到對數(shù)生長期，然后添加氯霉素至終濃度1μg/ml，升溫劍42℃誘導其溶解，制成了胸膜肺炎放線桿菌菌影。電鏡觀察菌影細胞形態(tài)完整保持了細菌的基本細胞形態(tài)，內(nèi)容物全部被釋放到胞外，細胞表面發(fā)生明顯的皺縮。本實驗構建的溶菌質(zhì)粒pBV-E和pGZRS-Eλ在各自宿主菌中的溶菌效率分別達到了99.86％和99.99％。本實驗為進一步研究菌影這一新型菌苗及佐劑形式

3、奠定了基礎。 將胸膜肺炎放線桿菌菌影疫苗以5×109cfu/只的劑量分兩種方式對實驗豬進行免疫：實驗Ⅰ組(肌肉注射免疫組)、實驗Ⅱ組(滴鼻免疫組)和對照組，實驗組每組6只，對照組4只。進行豬的免疫攻毒保護實驗。免疫共分2次，每次間隔兩周。第2次免疫后第14d，分別以APP1型菌(5x109cfu)和APP2型菌(5×109cfu)進行攻毒。以APP1全菌體為包被抗原，間接ELISA方法檢測血清抗體水平。結果表明，1免1周后肌肉注

4、射APPGhosts免疫后豬血清抗體水平明顯上升，與滴鼻免疫組和對照組相比差異顯著(p＜0.05)。1免2周抗體水平略有下降，2免1周后抗體水平明顯上升。2免2周后肌肉注射免疫組抗體水平略有上升，與滴鼻免疫組和對照組相比差異極顯著(p＜0.01)。而滴鼻免疫組與對照組的差異始終不顯著(p＞0.05)。攻毒2周后，根據(jù)攻毒后豬的存活率、肺臟病理變化及間接免疫熒光檢測，綜合評價胸膜肺炎放線桿菌菌影疫苗的免疫保護效果。結果表明，通過肌肉注射胸