豬胸膜肺炎放線桿菌PCR檢測(cè)方法及其外膜脂蛋白基因的表達(dá).pdf

1、豬胸膜肺炎放線桿菌(actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起豬傳染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia,PCP),給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失.大量研究工作證實(shí),APP的外膜脂蛋白(outer membrane lipoprotein,OML)具有較好的免疫原性,在PCP的免疫預(yù)防中起著重要作用.本實(shí)驗(yàn)參考已發(fā)表的APP OML基因序列,設(shè)計(jì)合成引物,通過P

2、CR方法,將APP QH-1、HN-7菌株的OML基因克隆到pMD18-T載體中,構(gòu)建重組質(zhì)粒AppOml-1和AppOml-7并進(jìn)行序列測(cè)定分析.結(jié)果表明,QH-1株OML基因的核苷酸序列與參考菌株1、9、11、12血清型的同源性高達(dá)99.1﹪以上,HN-7株OML基因的核苷酸序列與參考菌株3、4、6、7血清型的同源性高達(dá)97.3﹪以上,而與其它血清型參考菌株的同源性較低.對(duì)OML基因進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn),在其開放閱讀框架(open re

3、ading frame,ORF)兩端存在種間保守序列.據(jù)此設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物,經(jīng)PCR擴(kuò)增,APP1~10血清型標(biāo)準(zhǔn)菌株均能擴(kuò)增出大小為980 bp的DNA片段,而對(duì)其它具有類似癥狀的豬呼吸道病原菌擴(kuò)增結(jié)果均為陰性.檢測(cè)APP DNA的最低濃度為2 pg/mL.將臨床分離的6株APP進(jìn)行PCR檢測(cè),均為陽(yáng)性,與病原學(xué)鑒定的符合率為100﹪.由此證實(shí),此方法可以進(jìn)行APP的快速檢測(cè).利用PCR技術(shù)從重組質(zhì)粒AppOml-1中擴(kuò)增出包含完整

4、ORF的cAppOML-1基因,用EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ雙酶切cAppOML-1基因片段,定向亞克隆到經(jīng)同樣酶切處理的帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的表達(dá)載體pP<,R>oEX HTb中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pP<,R>ocAppOml-1,轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21,對(duì)陽(yáng)性克隆測(cè)序確認(rèn)閱讀框正確后,用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),收集不同時(shí)間的菌液進(jìn)行SDS-PAGE電泳,對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行Western-blot分析.結(jié)果表明,cAppOml-1基因在大腸桿菌中能成功表達(dá)