豬胸膜肺炎放線桿菌外毒素apxⅡA基因的原核表達以及ApxⅡA單克隆抗體的研制和APP復合PCR檢測方法的建立.pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)引起的一種高度接觸傳染性呼吸道疾病，該病給集約化養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。APP的胸膜肺炎放線桿菌毒素(Actinobacilluspleuropneumoniae toxin，Apx)是其主要的毒力因子，APP至少能產(chǎn)生4種不同的Apx外毒素，即ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ，目前己分離鑒定了15種血清型APP的Apx，

2、其毒力因子非常復雜，型間交叉免疫保護率低，因而該病的診斷與防制相當困難。己證實了ApxⅠ、ApxⅡ與ApxⅢ的溶血活性及對巨噬細胞與嗜中性粒細胞的毒性作用，且ApxⅢ被證實有誘導細胞凋亡的活性，而ApxIV僅具有微弱的溶血活性，其它作用尚不清楚。敏感、特異的診斷方法將有利于豬傳染性胸膜肺炎的控制。已知ApxⅡ存在于除10型以外所有血清型中，且具有種特異性，適合用于建立可以普查APP的診斷方法。為給APP外毒素作用機制的研究及其診斷方法的

3、建立提供單克隆抗體這一有用工具，開展了以下工作： 1．a(chǎn)pxⅡA基因的克隆與及其在大腸桿菌中的表達依據(jù)GenBank中公布的apxⅡA基因序列，利用引物設計軟件合成特異性引物，擴增了所需片斷，連接到pCR2.1載體中，獲得重組質粒pCR-apxⅡA，并進行了測序；確認正確后將片斷雙酶切并克隆到表達載體pGEX-6P-1的啟動子下游，構建了重組原核表達質粒pGEX-apxⅡA，轉化E coli DE3，測序無誤后經(jīng)IPTG誘導獲得

4、高效表達，經(jīng)SDS-PAGE分析，表達的重組蛋白的分子量約為130kD，命名為rApxⅡA，表達產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，Westem-blot證實表達產(chǎn)物具有良好的抗體結合特性。 2．天然外毒素的制備及純化從現(xiàn)有的APP1型標準株可以獲得ApxⅠ、ApxⅡ這兩種外毒素的混合物，在TSB培養(yǎng)基中加入適宜的輔酶I(NAD)以及鈣離子后，培養(yǎng)細菌過夜，離心后取上清，利用飽和硫酸銨沉淀法沉淀，用PBS重懸沉淀，透析3天后進行鑒定，SD

5、S-PAGE和Western-blot結果表明獲得所需毒素。 3．外毒素ApxⅡA單克隆抗體的制備用提取的天然毒素作為免疫原，免疫BALB/c小鼠，細胞融合后用重組蛋白rApxⅡA包被的酶標板通過間接ELISA檢測，得到兩株陽性雜交瘤細胞，能穩(wěn)定分泌單克隆抗體，分別命名為3A11、8B3。對空載體表達產(chǎn)物、致病性大腸桿菌、豬多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌的平行測定表明：兩株單克隆抗體的特異性良好。用小鼠腹水生產(chǎn)的上述2株單克隆抗體

6、的ELISA效價分別為51200、102400，單克隆抗體3A11屬于IgG<,1>亞類，8B3屬于IgG<,2a>亞類。 4．APP復合PCR方法檢測方法的建立根據(jù)GenBank中已發(fā)表的序列，分別設計針對APP cpx基因和apxⅣ基因的特異性引物，建立針對APP的多重PCR方法，可在一次PCR反應中擴增出相應的389bp和498bp的目的片段。應用這個多重PCR方法，對來自江蘇地區(qū)的97份疑似病料進行檢測，實驗結果表明這個