豬胸臘肺炎放線桿菌APXⅡ抗原表位表達及間接ELISA方法建立與應(yīng)用.pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎是由豬胸膜肺炎放線桿菌（APP）引起的一種以出血壞死性肺炎和纖維素性胸膜炎為特征的呼吸道傳染病，是危害現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的疾病之一。迄今，APP共有15個血清型。Apx毒素是APP主要的毒力因子和免疫原，15種血清型共產(chǎn)生四種毒素：ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ、ApxⅣ。Apx毒素分泌需要操縱子C、A、B、D4種基因的共同作用，A基因是毒素的結(jié)構(gòu)基因。除了血清10型，其余血清型均產(chǎn)生ApxⅡ。以ApxⅡ蛋白為基礎(chǔ)建立ELI

2、SA方法可作為一種跨越血清型障礙的檢測方法，對除10型外所有血清型作出檢測。本研究利用基因工程的方法表達ApxⅡA蛋白的主要抗原表位區(qū)，并基于此建立檢測豬血清中APP抗體的間接ELISA方法，為疾病診斷和疫苗免疫效果評估奠定了基礎(chǔ)。主要研究內(nèi)容如下：
　　1、豬胸膜肺炎放線桿菌ApxⅡ主要抗原表位區(qū)原核表達和優(yōu)化
　　將豬胸膜肺炎放線桿菌 ApxⅡ主要抗原表位區(qū)基因片段克隆至原核表達載體pET-28a(+)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pE

3、T-ApxⅡA1。將重組質(zhì)粒pET-ApxⅡA1轉(zhuǎn)化至宿主菌BL21（DE3）中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，外源基因獲得高效表達。最佳誘導(dǎo)條件為加入終濃度為1mmol/mL的IPTG37℃誘導(dǎo)5h，融合蛋白主要以包涵體的形式存在于沉淀中。通過Western-blot分析重組蛋白可被兔抗APP陽性血清特異性識別，表明表達產(chǎn)物具有良好的免疫原性。
　　2、基于ApxⅡ主要抗原表位區(qū)的間接ELISA方法建立
　　將豬胸膜肺炎放線桿菌Apx

4、Ⅱ主要抗原表位重組蛋白作為包被抗原，包被酶標(biāo)板，建立了檢測豬APP血清抗體的間接ELISA方法。通過反應(yīng)條件的優(yōu)化，初步確定了間接ELISA方法的最佳反應(yīng)條件：其抗原的包被濃度為1.23μg/mL；血清稀釋度為1：100；4℃包被過夜；1％BSA37℃封閉1h；一抗反應(yīng)時間為60min；酶標(biāo)二抗工作濃度為1：10000；最佳底物顯色時間為4min。確定了間接ELISA方法的臨界值，對其特異性和重復(fù)性進行了檢測，并與商品化ApxⅣ抗體檢測

5、試劑盒分別對94份臨床非免疫血清樣品進行檢測，兩者的符合率為90.4%，表明所建立的間接 ELISA方法具有良好的特異性、重復(fù)性。
　　3、江蘇安徽兩省部分豬場豬胸膜肺炎放線桿菌流行病學(xué)調(diào)查
　　用建立的間接ELISA方法對江蘇安徽兩省部分豬場2013年采集送檢的未免疫豬胸膜肺炎放線桿菌的血清共計552份檢測APP抗體，檢出230份，總陽性率為41.67%。江蘇送檢的12個豬場共460份血清，血清總陽性率為40.65%；安徽

6、送檢的5個豬場共92份血清，血清總陽性率為46.74%。其中種豬血清總計106份，血清總陽性率為64.15%；南通、徐州兩地豬場共送檢血清98份，妊娠母豬、育肥豬、保育豬、哺乳豬的血清陽性率分別為100%、25%、14.29%、84.21%。兩省的大部分豬場均存在豬胸膜肺炎放線桿菌感染情況，不同生長階段的豬群均可感染APP。
　　綜上所述，本試驗成功原核表達獲得豬胸膜肺炎放線桿菌ApxⅡ主要抗原表位區(qū)基因片段編碼的蛋白，建立了檢測