應(yīng)用NaOH制備胸膜肺炎放線桿菌菌影及其免疫效力評(píng)價(jià).pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎(Porcine Contagious Pleuropneumonia，PCP)是豬場(chǎng)常見(jiàn)的呼吸道傳染病，由胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）引起。該病傳播速度快，流行范圍廣，發(fā)病率高，死亡率高，嚴(yán)重阻礙了全球養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展。目前主要通過(guò)疫苗免疫防控該病。其中傳統(tǒng)滅活疫苗的使用最廣，但由于滅活疫苗免疫保護(hù)效果有限，無(wú)交叉保護(hù)性，因此研制一種能夠有效防治APP感染的

2、新型疫苗迫在眉睫。
　　菌影（bacterial ghost，BG）具有完整的胞外膜結(jié)構(gòu)，是一種無(wú)胞內(nèi)容物的空細(xì)菌體，其免疫原性強(qiáng)，同時(shí)具有佐劑功能。本文利用最小抑菌濃度的氫氧化鈉(NaOH)與APP細(xì)菌細(xì)胞作用，建立了一種制備APP菌影的新方法。分別將培養(yǎng)12h、24h、48h、72h的APP血清1型shope株菌液調(diào)至兩個(gè)濃度:1×108CFU/mL、1×109CFU/mL，測(cè)定NaOH對(duì)其最小抑菌濃度值;將不同培養(yǎng)時(shí)間、不同

3、濃度的菌液與對(duì)應(yīng)的最小抑菌濃度NaOH反應(yīng)，37℃孵育75min，間隔15min計(jì)算裂解率，確定菌影的制備條件。結(jié)果顯示，NaOH對(duì)不同條件的菌液均產(chǎn)生裂解作用，反應(yīng)75min內(nèi)裂解率均達(dá)到100％;經(jīng)掃描電鏡觀察，細(xì)菌外膜孔道明顯，菌體形態(tài)正常;透射電鏡觀察胞內(nèi)無(wú)內(nèi)容物。
　　通過(guò)免疫保護(hù)性試驗(yàn)測(cè)定APP菌影疫苗對(duì)BALB/c小鼠和外三元豬的保護(hù)作用。將228只5周齡BALB/c小鼠隨機(jī)分為19組，每組12只。一免14d二免，疫

4、苗腹腔免疫1×108CFU/只。二免后14d進(jìn)行攻毒。其中A1組(APP1型菌影疫苗)、A2組(APP1型滅活疫苗)和A3組(PBS對(duì)照)用APP血清1型參考菌株shope株攻毒;B1組(APP1型菌影疫苗)、B2組(APP1型滅活疫苗)、B3組(APP2型滅活疫苗)和B4組(PBS對(duì)照)用APP血清2型參考菌株S1536株攻毒;C1組(APP1型菌影疫苗)、C2組(APP1型滅活疫苗)、C3組(APP3型滅活疫苗)和C4組(PBS對(duì)照

5、)用APP血清3型參考菌株S1421株攻毒;D1組（APP1型菌影疫苗）、D2組（APP1型滅活疫苗）、D3組（APP5型滅活疫苗）和D4組（PBS對(duì)照）用APP血清5a型參考菌株K17株攻毒;E1組（APP1型菌影疫苗）、E2組(APP1型滅活疫苗)、E3組(APP7型滅活疫苗)和E4組(PBS對(duì)照)用APP7型參考菌株WF83株攻毒。稱量并計(jì)算各組小鼠平均體重（一免0d至28d，共稱量5次，每次間隔7d），組間進(jìn)行比較。ELISA檢

6、測(cè)各組小鼠抗體水平、小鼠細(xì)胞因子(IL-2、IFN-γ)表達(dá)量（血清取樣:一免0d至28d，共5次采血，每次間隔7d）。攻毒后14d剖解各組存活小鼠，觀察并分析肺臟組織病理變化。
　　抗體檢測(cè)結(jié)果顯示，免疫APP1型菌影疫苗和1型滅活疫苗的小鼠血清中APP血清1型特異性抗體水平與對(duì)照組相比差異極顯著(P＜0.01);其中在免疫APP1型菌影疫苗的小鼠血清中還檢測(cè)到一定水平的APP血清3型、5型、7型特異性抗體，雖抗體水平略低于經(jīng)同

7、型滅活疫苗免疫后的小鼠，但明顯高于1型滅活疫苗和對(duì)照組的小鼠。一免28d（二免14d），APP1型菌影疫苗組的小鼠血清中IL-2和IFN-γ的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)。經(jīng)APP1型菌株攻毒后，APP1型菌影疫苗和滅活疫苗組的小鼠剖解可見(jiàn)肺組織無(wú)病變，存活率為100％;APP2型、3型、5型、7型滅活疫苗組小鼠經(jīng)同型菌型株感染后，存活率分別為75％、33.33％、25％、50％;其中免疫APP1型菌影疫苗的小鼠經(jīng)APP3型、5

8、型、7型菌株感染后，存活率分別為41.7％、66.67％、50％，表現(xiàn)出一定的交叉保護(hù)性。
　　篩選9頭ApxⅣ抗體呈陰性的外三元豬，隨機(jī)分為3組:實(shí)驗(yàn)1組(APP1型菌影疫苗)、實(shí)驗(yàn)2組(APP1型滅活疫苗)和實(shí)驗(yàn)3組（空白對(duì)照組），肌肉注射免疫，免疫劑量4×109CFU/頭，一免14d二免。頸靜脈采血（一免0d至35d，共5次采血，每次間隔7d），ELISA檢測(cè)豬血清中ApxⅡ抗體水平，熒光定量PCR檢測(cè)豬全血中的細(xì)胞因子（I

9、L-2、IFN-γ）表達(dá)量。二免14d，采用APP血清1型參考菌株shope株進(jìn)行攻毒，攻毒后采集鼻拭子(攻毒后第1d至第7d，共采樣4次，每次間隔2d)、測(cè)量體溫（攻毒后第0d至14d）、記錄死亡數(shù)量，攻毒14d后剖解并分析各組豬只肺臟病變程度及帶菌狀況。抗體檢測(cè)結(jié)果顯示，一免21d，實(shí)驗(yàn)1組抗體明顯升高，與對(duì)照組相比差異極顯著（P＜0.01）;一免28d，實(shí)驗(yàn)1組IL-2、IFN-γ細(xì)胞因子表達(dá)量明顯高于其他兩組。攻毒后實(shí)驗(yàn)1組豬只