山東省貂源銅綠假單胞菌的分離鑒定及三價滅活菌對小鼠的免疫效力評價.pdf

1、水貂出血性肺炎是一種由銅綠假單胞菌（PA）引起的以肺部瘀血、敗血癥為主要特征的水貂急性呼吸道傳染病。該病以地方性流行為主，發(fā)病迅速，病死率高，常造成水貂養(yǎng)殖業(yè)巨大的經(jīng)濟損失。由于該病病原菌存在廣泛，耐藥菌株較多，致使貂感染發(fā)病后藥物治療效果不佳。目前認為，防治該病的主要措施是應用與致病菌血清型相匹配的滅活菌進行免疫接種。因此，水貂出血性肺炎流行地區(qū)的致病菌分離鑒定，血清型調查是制備多價滅活疫苗的前提和基礎。本研究開展了山東省水貂源銅綠假

2、單胞菌的分離鑒定、病原菌血清型分布調查和三價滅活菌對小鼠的免疫效力檢測等方面的研究。
　　病原菌分離鑒定。2013年至2014年，從山東省諸城、濰坊、臨沂、文登、日照、莒縣、膠南等地區(qū)的18個養(yǎng)貂場共采集77份病貂肺臟樣本，分離得到120株疑似銅綠假單胞菌。經(jīng)生化試驗、16S rDNA的PCR擴增和血清型鑒定，最終確定其中53株分離菌為銅綠假單胞菌，分離率為44.2％(53/120)。53株銅綠假單胞菌包含11個已知血清型和一株未

3、確定型。其中G型菌株最多，有27株;其次為B型、D型，分別為5株和4株。分離菌株中主要流行血清型為G型、B型和D型。
　　免疫原的篩選。將分屬于11個血清型的15株銅綠假單胞菌分別用甲醛滅活，與佐劑混合后對新西蘭白兔連續(xù)免疫三次，采集免疫血清。用免疫血清分別與15株菌做交叉凝集試驗，結果顯示，G型、B型、D型、N型血清與多種血清型的菌株發(fā)生凝集。依據(jù)血清型鑒定結果和血清學交叉保護結果確定可以作為水貂出血性肺炎滅活疫苗的血清型為G、

4、B、D型。通過血清交叉凝集試驗、對小鼠半數(shù)致死量測定和生長曲線測定，確定了候選疫苗株為SD004、SD050、SD052。
　　三價滅活菌免疫效力檢測。測定候選株SD004、SD050、SD052傳代穩(wěn)定性，結果顯示候選株SD004、SD050、SD052在20代內連續(xù)傳代菌體含量雖有所變化，但都在同一數(shù)量級內浮動;20代內3株疫苗候選株致病性也在同一數(shù)量級內波動，3株候選株20代內的生長性能、致病性均穩(wěn)定;對三株疫苗株進行包括培

5、養(yǎng)基的選擇，培養(yǎng)溫度、時間、培養(yǎng)基pH等培養(yǎng)條件的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)37℃條件下pH7.0～7.5的肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)22～24h對候選株菌液生產(chǎn)應用最適宜;分別用相同菌體含量不同免疫劑量的三價滅活菌免疫昆明鼠，21d后用10 LD50的候選株菌液攻毒，確定疫苗對小鼠的最小免疫劑量為0.15mL，即接種1.125×1011CFU三價滅活菌可以保證小鼠受到100％保護;小鼠肺臟病理組織學觀察發(fā)現(xiàn)疫苗免疫劑量的增強可以有效保護小鼠，預防銅綠假單胞菌的

6、感染;血清抗體水平檢測表明水貂出血性肺炎三價滅活菌免疫小鼠后在28 d血清抗體達到峰值，42 d開始下降，49 d仍能檢測到抗體存在;同時發(fā)現(xiàn)對小鼠兩次免疫血清抗體滴度比一次免疫的抗體滴度要高，保護效果更好;將三價滅活菌0.15 mL/只免疫昆明鼠，21 d后攻毒，小鼠無一死亡，證明其受到100％免疫保護。同時剖取免疫組小鼠的肺、腎、肝等內臟，發(fā)現(xiàn)免疫過三價滅活菌的小鼠攻毒后小鼠內臟無明顯病理學變化，進一步證明三價滅活菌可以對小鼠提供有