固有免疫系統(tǒng)在銅綠假單胞菌肺部感染中的作用.pdf

1、銅綠假單胞菌肺部感染是醫(yī)院感染死亡的主要原因之一。作為機(jī)會致病菌，銅綠假單胞菌可以根據(jù)環(huán)境改變自身基因表達(dá)，具有極強(qiáng)的適應(yīng)能力和適時多變的毒力，通過與宿主免疫系統(tǒng)相互作用、相互調(diào)節(jié)共同決定著感染的結(jié)局。肺固有免疫系統(tǒng)在銅綠假單胞菌感染中起著重要作用，對其機(jī)制的深入研究對臨床工作有指導(dǎo)意義。為此，本文擬從分子水平、細(xì)胞水平、器官水平研究不同狀態(tài)下同一株銅綠假單胞菌引起感染時宿主固有免疫系統(tǒng)(TLRs和NOD2)的變化和功能，為臨床診斷和治

2、療提供理論依據(jù)。 方法：1.本研究采用銅綠假單胞菌ATCC 27853通過LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)法和體外改良平板培養(yǎng)法分別建立浮游菌和生物被膜菌。分別用這兩種狀態(tài)下的菌株作用于人呼吸道上皮細(xì)胞株A549、HBE，構(gòu)建體外感染模型。采用RT-PCR和Western blot方法檢測TLR2、TLR4、TLR5和NOD2的表達(dá)、ELISA法檢測細(xì)胞上清中IL-6、IL-8水平，應(yīng)用Western blot方法測定浮游菌感染模型中TRAF

3、6、NF-кB蛋白表達(dá)量。2.采用分別處于上述兩種狀態(tài)的菌株建立大鼠銅綠假單胞菌肺部感染模型，按隨機(jī)原則將66只SD大鼠分為對照組、浮游菌感染組、生物被膜菌感染組。分別于浮游菌感染組建模后4h、1d、3d，生物被膜菌感染組建模后4h、7d、14d采集標(biāo)本，進(jìn)行肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察，采用RT-PCR、Western blot法檢測肺組織TLR2、TLR4、TLR5和NOD2的表達(dá)。3.浮游菌作用A549細(xì)胞4h后，提取細(xì)胞上清中的分泌蛋白

4、進(jìn)行雙向凝膠電泳，尋找表達(dá)差異顯著的蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。 結(jié)果：1.體外感染模型中，TLR2的表達(dá)無明顯差異(P>0.05)；TLR4在浮游菌和被膜菌感染4h組表達(dá)上調(diào)(P<0.05)， TLR5mRNA水平在浮游菌作用的15min即發(fā)生明顯上調(diào)，至作用30min組升至最高點(diǎn)，隨后有下降趨勢(P<0.05)；TRAF6和NF-кB與TLR5的表達(dá)情況基本一致。IL-6、IL-8水平隨著作用時間的延長逐漸上調(diào)(P<0.05)。2.

5、動物感染模型中，浮游菌感染組和被膜菌感染組的病理變化差異明顯。浮游菌感染組中，TLR2的表達(dá)無明顯差異(P>0.05)；TLR4的表達(dá)在3d組中上調(diào)(P<0.05)；TLR5水平在4h組顯著增高以后逐漸下調(diào)(P<0.05)；NOD2的表達(dá)在4h組上調(diào)后恢復(fù)正常(P<0.05)。生物被膜菌感染組中，TLR2、TLR5、NOD2的表達(dá)逐漸增高(P<0.05)，TLR4的表達(dá)在d14組明顯增高(P<0.05)。3.獲得了分辨率和重復(fù)性較好的雙

6、向凝膠電泳圖譜，取對照組和浮游菌處理組中表達(dá)差異顯著的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行肽質(zhì)指紋分析，經(jīng)數(shù)據(jù)庫查詢，表達(dá)差異顯著的蛋白可能為Notchless protein homolog 1，其功能尚未闡明。 結(jié)論：處于不同狀態(tài)下的同一菌株引起感染的病程和結(jié)局不同，銅綠假單胞菌根據(jù)外環(huán)境調(diào)節(jié)自身狀態(tài)在機(jī)會感染中有重要意義；不是TLR2/TLR4而是鞭毛蛋白結(jié)合TLR5介導(dǎo)的MyD88/TRAF6/NF-кB信號通路在銅綠假單胞菌感染初始階段起主要