銅綠假單胞菌群體感應(yīng)抑制劑的分離與活性評(píng)價(jià).pdf

1、目前，細(xì)菌耐藥問題日益嚴(yán)重，使傳統(tǒng)抗生素面臨著失效的危險(xiǎn)，直接威脅到人類的生命健康。因此，尋找新的靶點(diǎn)來(lái)開發(fā)新型抗菌藥物具有重要意義。群體感應(yīng)(Quorum sensing，QS)是指細(xì)菌通過(guò)感知菌群中信號(hào)分子的濃度變化，從而對(duì)周圍環(huán)境做出自身調(diào)整以抵抗不利因素的行為。QS系統(tǒng)調(diào)控著致病菌的多種行為如生物被膜的形成及毒力因子的表達(dá)。銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）是一種常見的機(jī)會(huì)致病菌，它的耐藥性及毒力使得治療

2、銅綠假單胞菌感染十分困難。P.aeruginosa的群體感應(yīng)(QS)系統(tǒng)對(duì)其致病力及毒力的產(chǎn)生（如綠膿菌素、鼠李糖脂、彈性蛋白酶、swarming運(yùn)動(dòng)、生物被膜的形成等）具有重要調(diào)控作用。因此，干擾P.aeruginosa QS系統(tǒng)是削弱其毒力的一個(gè)發(fā)展策略。群體應(yīng)抑制劑（Quorum sensing inhibitors，QSIs）能夠降低P.aeruginosa毒力及致病力，同時(shí)不抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，與傳統(tǒng)抗生素相比不會(huì)對(duì)細(xì)菌的生存產(chǎn)生

3、選擇性壓力，理論上不易產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性，為新型抗感染藥物的研究提供了一條新的途徑。
　　本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中發(fā)現(xiàn)海洋真菌Aspergillus sp.SY012的發(fā)酵產(chǎn)物及中藥厚樸的粗提物具有銅綠假單胞菌群體感應(yīng)抑制活性。本文目的是從Aspergillussp.SY012的發(fā)酵產(chǎn)物及厚樸的粗提物中追蹤分離群體感應(yīng)抑制劑，并對(duì)其活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　利用P.aeruginosa（QSIS-lasI）及P.aeruginosa（PQ

4、SI-pqsA）報(bào)告菌株追蹤檢測(cè)Aspergillus sp.SY012發(fā)酵粗提物的活性，采用硅膠柱層析、SephadexLH-20凝膠柱層析、HPLC對(duì)活性成分進(jìn)行分離純化，最終得到兩個(gè)活性化合物，利用核磁共振波譜解析確定化合物結(jié)構(gòu)分別為α-環(huán)匹阿尼酸及其同分異構(gòu)體異α-環(huán)匹阿尼酸。數(shù)據(jù)分析表明，在亞抑菌濃度下，它們對(duì)P.aeruginosa PAOI的彈性蛋白酶活性、綠膿菌素及鼠李糖脂產(chǎn)量、swarming運(yùn)動(dòng)等毒力因子都具有顯著抑

5、制作用，并且可顯著降低las、rhl及pqs系統(tǒng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。利用大腸桿菌異源報(bào)告菌株E.coli MG4/pKDT17和E.coli pEAL08-2檢測(cè)異α-環(huán)匹阿尼酸及α-環(huán)匹阿尼酸對(duì)las和pqs群體感應(yīng)系統(tǒng)的作用，異α-環(huán)匹阿尼酸及α-環(huán)匹阿尼酸對(duì)于異源表達(dá)的las及pqs系統(tǒng)均有顯著抑制作用，其中相同濃度的異α-環(huán)匹阿尼酸活性強(qiáng)于α-環(huán)匹阿尼酸。二者具有相同的平面結(jié)構(gòu)，唯一不同就是5位C的立體結(jié)構(gòu)，可能對(duì)化合物的Q

6、SI活性起到重要作用。
　　利用了P.aeruginosa（QSIS-lasI）報(bào)告菌株對(duì)中藥厚樸的粗提物進(jìn)行活性追蹤及檢測(cè)，得到明顯的活性位點(diǎn)，采用生物自顯影薄層色譜、制備薄層色譜和高效液相色譜技術(shù)分離到活性化合物，通過(guò)核磁共振波譜解析確定活性化合物為和厚樸酚。在亞抑菌濃度下，和厚樸酚能夠抑制P.aeruginosa PAOI毒力因子的產(chǎn)生，包括swarming運(yùn)動(dòng)、綠膿菌素及鼠李糖脂產(chǎn)量，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明和厚樸酚對(duì)P.

7、aeruginosa PAOI QS相關(guān)調(diào)控基因的mRNA表達(dá)水平有顯著抑制作用。和厚樸酚(honokiol)是具有抗氧化，抗炎，抗焦慮，抗抑郁等多種生物活性的多酚，為厚樸的主要成分。和厚樸酚作為P.aeruginosa QSI，是它生物活性的又一新發(fā)現(xiàn)。
　　本文從Aspergillus sp.SY012的發(fā)酵產(chǎn)物及中藥厚樸的粗提物中分離得到了銅綠假單胞菌群體感應(yīng)抑制劑，并首次發(fā)現(xiàn)α-環(huán)匹阿尼酸、異α-環(huán)匹阿尼酸及和厚樸酚具有Q