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文檔簡介
1、背景:
醫(yī)院內(nèi)獲得性感染(HAI)已成為人類健康最大威脅之一,而銅綠假單胞菌(Pseudomonas areuginas,PA)是則HAI致病菌中重要的一種。該菌為革蘭陰性桿狀條件致病菌,患者抵抗力低下或有侵入性操作可導致感染概率明顯增加。PA也是呼吸科、重癥監(jiān)護病房(ICU)感染的重要病原菌,隨著廣譜抗菌藥物、免疫抑制劑、腫瘤化療藥物等的普遍使用,加之該菌易定植、易變異、耐藥機制復雜,其耐藥性及多重耐藥性顯著增強,已成為臨床
2、治療亟待解決的難題。目前PA對常用抗菌藥物耐藥率逐漸升高,所以深入研究PA的致病和耐藥機制、合理使用抗生素以及開發(fā)新型抗菌藥物對有效治療PA感染、改善患者預后、降低病死率至關重要。
目前關于治療PA感染,最主要的方法仍然是使用抗生素等抗菌藥物,臨床上治療PA感染的抗菌藥物主要包括β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類、多粘菌素類藥物等。環(huán)丙沙星是目前抗假單胞菌活性最強的喹諾酮類藥物,但隨著其在臨床上的廣泛應用,PA對環(huán)丙沙星的耐藥
3、性也逐年增強,所以尋找新型抗菌藥物已是當務之急。
亞油酸是人體必需脂肪酸,脂肪酸作為活性物質(zhì)和藥物載體已應用于制藥行業(yè)。ω-3脂肪酸在治療糖尿病、抗癌、抗炎以及免疫調(diào)節(jié)活動中的作用使人們開始研究其對微生物活動的影響。在細菌中,游離脂肪酸通過多種方式作用于細菌細胞膜,使細菌繁殖受阻或引起細胞凋亡樣的殺菌效應。但將亞油酸應用于抗菌治療方面的研究報道還較少。
SOS反應也稱應急反應,指DNA受到嚴重損傷時,多種基因誘導的D
4、NA修復以維持DNA的完整性。SOS反應由激活蛋白RecA和阻遏蛋白LexA等相互調(diào)控。DNA受到損傷后與RecA結(jié)合,結(jié)合后促使LexA發(fā)生自我切割,于是SOS修復酶類相繼合成。SOS反應則與銅綠假單胞菌生物膜、綠膿菌素產(chǎn)生等有關。
群體感應(Quorum-sensing,QS)系統(tǒng)是指當環(huán)境中的微生物種群密度達到閾值時,相關信號分子也達到一定水平,通過一些相關蛋白比如受體蛋白的信號傳遞,誘導或者阻止信號最終傳遞到細胞內(nèi),影
5、響細菌特定基因的表達,調(diào)控微生物群體的生理特征,如生物發(fā)光、抗生素合成,生物膜形成等以適應環(huán)境變化。通過QS機制進行“細胞對細胞”的交流,細菌能夠在惡劣的環(huán)境中協(xié)調(diào)一致,以“團隊作戰(zhàn)能力”使整個種群更好地存活下來。QS系統(tǒng)主要包括lasI-lasR信號系統(tǒng)和rhlI-rhlR信號系統(tǒng)。當環(huán)境中存在抗菌劑等不利因素時,銅綠假單胞菌的QS系統(tǒng)會介導自身產(chǎn)生外毒素A和彈性蛋白酶等,增強自身致病性。
目的:
通過抑菌實驗證實
6、亞油酸的抑菌作用。qRT-PCR檢測SOS反應相關基因RecA在mRNA水平上的表達,分析作為不同類型的抗菌劑,亞抑菌濃度的環(huán)丙沙星和亞油酸在不同時間點誘發(fā)銅綠假單胞菌產(chǎn)生SOS反應的情況,再通過qRT-PCR檢測QS系統(tǒng)相關基因(lasI、lasR、rhlI、rhlk)的表達,分析在SOS反應條件下,銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)和致病能力的變化,以期深入了解銅綠假單胞菌致病機制以及認識到藥物劑量不足給臨床治療帶來的危害,協(xié)助抗菌藥物研發(fā)和指導
7、臨床合理用藥。
方法:
1.從臨床病人體內(nèi)分離、培養(yǎng)銅綠假單胞菌,以銅綠假單胞菌ATCC27853為質(zhì)控菌株,雙重PCR法鑒定該菌株。
2.培養(yǎng)基稀釋法和肉眼觀察法測定環(huán)丙沙星和亞油酸對銅綠假單胞菌的最低抑菌濃度(MIC),并進一步分別測定了陰性對照組、3/4MIC、2/4MIC、1/4MIC環(huán)丙沙星/亞油酸組的細菌生長狀況。
3.qRT-PCR分析亞抑菌濃度的環(huán)丙沙星和亞油酸在不同時間點(4h和
8、24h)對銅綠假單胞菌SOS反應的影響。
4.qRT-PCR分析SOS反應條件下銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)的變化情況。
5.檢測SOS反應條件下,銅綠假單胞菌生物膜、綠膿菌素和胞外DNA的表達情況,分析其致病能力的變化。
結(jié)果:
1.培養(yǎng)基稀釋法和肉眼觀察法確定環(huán)丙沙星MIC為2μg/ml,亞油酸MIC為1.5mg/ml,且生長曲線圖表明最低抑菌濃度下細菌生長受到明顯抑制。
2.qRT-PCR
9、結(jié)果顯示,在4h時間點,亞抑菌濃度的環(huán)丙沙星和亞油酸均使RecA上調(diào),且環(huán)丙沙星組RecA表達量高于亞油酸組;在24h時間點,亞抑菌濃度的環(huán)丙沙星和亞油酸均使RecA下調(diào)。
3.qRT-PCR結(jié)果顯示,在4h時間點,亞抑菌濃度的環(huán)丙沙星和亞油酸均使lasI、lasR、rhlI、rhlR基因上調(diào),且環(huán)丙沙星組lasI、lasR、rhlI、rhlR表達量高于亞油酸組;在24h時間點,亞抑菌濃度的環(huán)丙沙星和亞油酸均使lasI、las
10、R、rhlI、rhlR基因下調(diào)。
4.檢測生物膜、綠膿菌素和eDNA表達量,結(jié)果顯示,亞抑菌濃度的環(huán)丙沙星和亞油酸均使其表達量增加,且環(huán)丙沙星組表達量高于亞油酸組。
結(jié)論:
1.低于MIC劑量的環(huán)丙沙星和亞油酸在短時間內(nèi)會引起銅綠假單胞菌的SOS反應,隨著時間的增長,細菌逐漸適應這種不利環(huán)境并啟動一系列保護機制,所以在24h時間點,SOS反應下降。
2.qRT-PCR結(jié)果顯示,低于MIC劑量的環(huán)丙
11、沙星和亞油酸對銅綠假單胞菌SOS反應和QS系統(tǒng)的調(diào)節(jié)是一致的。SOS反應被激活時,QS系統(tǒng)表達增強;SOS反應被抑制時,QS系統(tǒng)表達也下降。即SOS反應條件下,QS系統(tǒng)活性增強。此外,較環(huán)丙沙星,低于MIC劑量的亞油酸能引起銅綠假單胞菌較低的SOS反應和QS系統(tǒng)表達。
3.SOS反應條件下,銅綠假單胞菌致病性增強,而亞油酸能引起相對較低的致病性。側(cè)面反映臨床給藥劑量不足可能會引起病原菌致病性增強,不利于根治細菌感染。
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