禽波氏桿菌的定植規(guī)律、基因分型以及與REV共感染的協(xié)同致病作用研究.pdf

1、禽波氏桿菌(Bordetellaavium，B.avium)最早于1967年分離自火雞，主要引起禽類的鼻炎、眼炎等呼吸道癥狀。近年來(lái)不斷從出現(xiàn)孵化率降低和弱雛率增高的種雞孵化場(chǎng)雞胚中分離到該菌，為探明其致病性的變化，本研究對(duì)2001-2011年間出現(xiàn)疫情的規(guī)?；N雞孵化場(chǎng)的致病病原進(jìn)行了分析，然后對(duì)分離到的B.avium菌株進(jìn)行了強(qiáng)毒株的篩選以及基因分型，對(duì)篩選到的強(qiáng)毒株進(jìn)行了定植規(guī)律檢測(cè)，并研究了其在免疫抑制狀態(tài)下致病性的變化。

2、>　　 本研究共分為五個(gè)部分：
　　 1.規(guī)模化種雞孵化場(chǎng)胚胎性疫病病原分析
　　 本試驗(yàn)對(duì)2001～2011年間全國(guó)8省市共計(jì)72個(gè)種雞孵化場(chǎng)送檢或采集的將出殼死亡雞胚或死亡的剛出殼雛雞進(jìn)行了病原的檢測(cè)和分析。經(jīng)多重PCR和RT-PCR擴(kuò)增以及細(xì)菌、支原體的分離培養(yǎng)，在33個(gè)孵化場(chǎng)檢測(cè)到了雞傳染性貧血病毒(CIAV)、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增殖癥病毒(REV)和雞白血病病毒(ALV)三種病毒的單純感染和多重感染，占45.8％；有

3、6個(gè)孵化場(chǎng)存在有支原體感染，占檢測(cè)孵化場(chǎng)總數(shù)的8.33％；在52個(gè)孵化場(chǎng)檢測(cè)到了細(xì)菌的單純感染或多重感染，占到了72.2％。共分離到禽波氏桿菌、葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌和綠膿桿菌5種細(xì)菌，共計(jì)105株。在檢測(cè)的47種藥物中5類細(xì)菌耐受藥物的數(shù)量在15-32種，耐藥性總體呈上升趨勢(shì)，其中以葡萄球菌的蜊藥最為嚴(yán)重。孵化率下降、弱雛率增加等狀況主要由細(xì)菌的多重感染(47.22％)和病毒與細(xì)菌的共感染(19.44％)引起，單純的病毒、細(xì)菌和

4、支原體的感染僅占了極少的比例，分別為6.94％、9.72％和4.71％。
　　 2.B.avium雞胚分離株的生物學(xué)特性及致病性研究
　　 1991-2010年間分離到的22株B.avium菌株的培養(yǎng)特性及塵化特征基本一致，且均具有不同程度的耐藥性。在所檢測(cè)的47種藥物中，不同分離株耐受藥物數(shù)量為8-30種。對(duì)近年來(lái)的12株雞胚分離株進(jìn)行11日齡雞胚ELD50和1日齡雛雞LD50的測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ELD50在6.75-27

5、.95CFU之間，LD50在9.2×105-3.4×108CFU之間，從中篩選出3株毒力較強(qiáng)的菌株Ba15、Ba17和Ba21。3株B.avium經(jīng)鼻腔感染1日齡雛雞后發(fā)現(xiàn)Ba15對(duì)雛雞的生長(zhǎng)抑制和ND油苗免疫后的抗體水平增長(zhǎng)的抑制作用最強(qiáng)，在肺臟和氣管中的感染率為100％，在各內(nèi)臟中引起感染的雞只比例在30％～40％。對(duì)Ba15以不同方式感染雛雞發(fā)現(xiàn)腹腔感染的危害最嚴(yán)重，生長(zhǎng)抑制和免疫抑制作用最強(qiáng)，內(nèi)臟的感染比例最高(100％)，比較

6、接近胚胎期感染，經(jīng)鼻腔和經(jīng)眼兩種方式感染的比較發(fā)現(xiàn)鼻腔感染的危害略強(qiáng)于經(jīng)眼感染，B.avium入侵內(nèi)臟的雞只比例分別為30-40％和30％。
　　 3.禽波氏桿菌鼻腔攻毒雛雞的定植規(guī)律研究
　　 用篩選到的強(qiáng)毒株Ba15經(jīng)鼻腔感染1d雛雞，采用組織勻漿涂布細(xì)菌計(jì)數(shù)法、接種環(huán)劃線法、抹片染色法以及建立的細(xì)胞內(nèi)抗原原位檢測(cè)的間接免疫酶和間接免疫熒光組化法進(jìn)行細(xì)菌感染后在組織中的實(shí)時(shí)和定位檢測(cè)，在感染后1h即可在氣管和肺臟中檢

7、測(cè)到少量的B.avium，攻毒后12h內(nèi)肺臟中細(xì)菌的數(shù)量急劇上升，5d時(shí)入侵肝臟、心臟和脾臟，7d時(shí)發(fā)現(xiàn)其在腎臟的感染。內(nèi)臟感染后的荷菌數(shù)量高峰期出現(xiàn)在14-28日齡，35日齡后在內(nèi)臟中的感染比例逐漸下降，和B.avium感染后抗體水平的增長(zhǎng)以及抗病能力的增強(qiáng)直接相關(guān)。經(jīng)過(guò)間接免疫酶和間接免疫熒光組化檢測(cè)B.avium感染后在組織細(xì)胞中的定植部位主要是位于胞漿和細(xì)胞間質(zhì)中，且呈彌散性分布。
　　 4.禽波氏桿菌RAPD基因分型研

8、究
　　 用細(xì)菌基因組抽提試劑盒對(duì)22株禽波氏桿菌的DNA進(jìn)行提取，獲得了高純度和高濃度的細(xì)菌基因組DNA，并建立了穩(wěn)定性和重復(fù)性好的RAPD擴(kuò)增程序。經(jīng)過(guò)對(duì)一系列隨機(jī)引物的篩選，有6條引物能夠產(chǎn)生清晰且多態(tài)性好的條帶。運(yùn)用篩選的6條隨機(jī)引物對(duì)22株B.avium進(jìn)行擴(kuò)增，獲得了RAPD指紋圖譜。運(yùn)用分析軟件對(duì)指紋圖譜進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算出各菌株間的遺傳距離并進(jìn)行聚類分析，繪制親緣關(guān)系樹狀圖，最終以遺傳距離0.402為界將22株B

9、.avium分成了3個(gè)聚類群，其中第一聚類群又可以分為3個(gè)亞群，第三聚類群可以分為兩個(gè)亞群。其中第一聚類群包括了2000年之前的10個(gè)分離株(Ba1-Ba10)和2001年之后分離到的Ba12、Ba13、Ba14、Ba20,第二聚類群和第三聚類群中均為2001年之后的分離株，其中Ba15、Ba17、Ba18、Ba22屬于第二聚類群，Ba11、Ba16、Ba19和Ba21屬于第三聚類群。
　　 5.REV與禽波氏桿菌共感染的致病作

10、用研究
　　 B.avium單純感染雞胚致病力較弱，雞胚死亡時(shí)間較晚，主要危害是產(chǎn)生大量弱雛，且孵出的雛雞長(zhǎng)期帶菌，生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)蛋日齡延后。REV與B.avium共感染雞胚比B。avium單純感染時(shí)的雞胚死亡時(shí)間提前，孵化率僅為30％，死胚率、弱雛率增高，且弱雛的最終成活率為0。B.avium單純感染和與REV的共感染對(duì)不同日齡雛雞的LD50的檢測(cè)表明，雛雞的感染日齡至關(guān)重要，不管是單純感染組還是共感染組，高日齡的LD50值明顯

11、高于低日齡感染組。胚胎期及1日齡REV感染均顯箸降低了B.avium對(duì)不同日齡雛雞LD50,尤其是胚胎期REV后B.avium對(duì)1日齡雛雞的LD50值最低。REV作為一種免疫抑制性病毒，感染越早對(duì)B.avium的LD50影響越大。
　　 B.avium單純鼻腔感染對(duì)雛雞的生長(zhǎng)抑制和免疫抑制作用均較弱，但胚胎期REV感染的雛雞再經(jīng)鼻腔感染B.avium后，對(duì)生長(zhǎng)抑制和免疫抑制均具有協(xié)同作用，尤其是免疫抑制方面，盡管是以REV引起為

12、主，但與B.avium共感染后加快了免疫器官細(xì)胞的凋亡、壞死，并且使抗體水平的持續(xù)時(shí)間縮短。另外共感染還提高了雞群中“僵雞”的比例，使B.avium在內(nèi)臟中的檢出時(shí)間提前、感染比例增大，并且在內(nèi)臟中的持續(xù)感染時(shí)間延長(zhǎng)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在共感染組中繼發(fā)其他細(xì)菌感染的病例數(shù)增多。
　　 B.avium單純于1、7、14、和21日齡經(jīng)鼻腔感染雛雞時(shí)發(fā)現(xiàn)，感染日齡至關(guān)重要，1日齡和7日齡的雛雞比較敏感，21日齡感染組癥狀上僅表現(xiàn)為一過(guò)性感染。

13、不同日齡感染組之間相比，感染日齡越低對(duì)雛雞的生長(zhǎng)抑制和免疫抑制越嚴(yán)重，B.avium入侵內(nèi)臟的病例數(shù)也越多。1日齡雛雞感染REV后再分別于1、7、14、和21日齡經(jīng)鼻腔感染B.avium發(fā)現(xiàn)，在對(duì)雛雞的生長(zhǎng)抑制和免疫抑制上具有一定的協(xié)同作用，并且各日齡共感染組與單純感染組相比內(nèi)臟的感染比例均有不同程度的增加。在共感染組中低日齡時(shí)雛雞對(duì)B.avium的易感性仍強(qiáng)于高日齡，但感染日齡之間的差異在顯著縮小。
　　 總之，本研究結(jié)果表明