HIV-HCV共感染對pDC-NK細胞間作用的影響.pdf

1、目的：探討兩種天然免疫細胞，漿細胞樣樹突狀細胞（PlasmacytoidDendritic Cell，pDC）和自然殺傷(Natural Killer,NK)細胞的相互作用及機制;研究HIV/HCV單感染以及共感染對pDC-NK細胞間作用的影響，為了解HIV和HCV兩種病毒感染的相互作用提供新信息。
　　方法：
　　1.利用健康人的pDC、NK細胞研究pDC-NK相互作用的機制:利用磁珠法分離pDC和NK細胞，建立pDC-N

2、K細胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)，確認系統(tǒng)內兩種細胞在體外被激活時相關因子（IFN-α、WN-γ、Perforin、Fasl、Granzyme-B）的表達以及細胞間作用;進行transwell試驗，探討pDC-NK細胞直接接觸在細胞系統(tǒng)激活中的作用;
　　2.利用感染人群（HIV單感染，HCV單感染，HIV/HCV共感染）及健康對照人群研究病毒感染對pDC-NK細胞相互作用的影響:采集病毒感染人群的血樣樣本，分離pDC和NK細胞，在不同感染組分

3、別進行pDC-NK細胞系統(tǒng)激活試驗，通過與健康人群組相比，分析病毒感染對pDC-NK細胞系統(tǒng)的影響。
　　結果：
　　1.pDC-NK細胞系統(tǒng)的激活機制
　　1.1 pDC可在體外條件下被激活并大量釋放IFN-α:向新鮮分離的pDC中加入TLR-9受體激動劑ODN2216，對照組用ODN2243處理。ODN2216處理組的IFN-α mRNA表達顯著高于ODN2243對照組，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。
　

4、　1.2 體外條件下，NK細胞可經由TLR-9通路激活的pDC細胞達到激活狀態(tài)，表達相關細胞因子:使用ODN2216處理新鮮分離的NK細胞，結果表明NK細胞相關細胞因子（IFN-γ、 Pefforin、Fasl、Granzyme-B）在mRNA水平上表達沒有明顯變化(P＞0.05)。但在加入ODN2216的同時，按NK細胞數量10∶1的比例加入少量pDC后，上述NK細胞相關因子在mRNA水平上的表達顯著上升（四個因子的表達與ODN224

5、3對照組相比，p＜0.05）。
　　1.3 pDC與NK細胞直接接觸不是NK細胞激活的主要因素:在上述試驗的基礎上進行transwell試驗，transwell培養(yǎng)法使細胞在不能直接接觸但能保留培養(yǎng)液互通的條件下進行培養(yǎng)。結果表明，在沒有直接接觸的條件下，NK細胞依舊可以被激活(Perforin、Fasl、Granzyme-B的表達上調，與ODN2243對照組相比，p＜0.05)。直接比較ODN2216處理的transwell共培

6、養(yǎng)和直接接觸共培養(yǎng)組(不使用transwell)，結果顯示在無細胞直接接觸的條件下，NK細胞相關因子的表達沒有顯著性的變化(p＞0.05)。
　　2.HIV/HCV單感染與共感染對pDC-NK細胞系統(tǒng)的影響
　　2.1 HIV單感染上調pDC IFN-α mRNA的本底表達，即HIV單感染組pDC空白組（未經ODN2216體外激活）（198.98±10.74）與健康人群組pDC空白組IFN-α mRNA相對表達量相比，出現顯

7、著性的升高(p＜0.01);但是pDC激活組（ODN2216體外激活），HIV單感染組IFN-α mRNA相對表達量（185.69±16.63）明顯低于健康人群pDC激活組（240.08±28.26）(p＜0.01)，HIV可能損害了pDC的TLR-9通路的體外激活。
　　同時，HIV感染pDC-NK細胞系統(tǒng)ODN2216激活組Granzyme-B mRNA水平的表達（67.20±20.37）與健康人群激活組（1.21±0.31）

8、相比，表達有上升趨勢(p＜0.01)。
　　2.2 HCV單感染上調pDC IFN-α mRNA的本底表達（44.23±8.80），同時，HCV能促進pDC經TLR-9途徑激活表達IFN-α mRNA，跟健康人群pDC激活組相比，相對表達量有上升趨勢(474.53±10.62 vs249.08±28.26)(p＜0.01)。
　　HCV單感染組pDC-NK細胞系統(tǒng)的部分因子的本底表達下降（IFN-γ:0.44±0.51，Fa

9、sl:0.52±0.28），而Granzyme-B本底表達量上升（59.21±26.34）(p＜0.05)。HCV感染影響了pDC-NK細胞系統(tǒng)本底水平的相互作用。
　　2.3 HIV/HCV共感染時與HIV/HCV單感染類似，pDC IFN-α mRNA的本底表達高于健康人群的本底表達（567.51±59.50，p＜0.01）;HIV/HCV共感染也能促進pDC經TLR-9途徑激活表達IFN-α mRNA（567.51±59.5

10、0 vs249.08±28.26，p＜0.01）。同時，HIV/HCV共感染能夠提高pDC-NK細胞系統(tǒng)相關因子的本底表達。
　　結論：本研究成功建立了pDC-NK細胞體外培養(yǎng)及激活系統(tǒng)，在體外通過TLR-9通路激活pDC后，通過活化的pDC所分泌的多種細胞因子激活NK細胞。本研究表明pDC-NK細胞間相互作用也不是通過細胞間的直接接觸引發(fā)，而是通過pDC細胞產生的一系列細胞因子引發(fā)。本研究進一步探討了HIV和HCV單感染和共感染

11、對體外pDC-NK細胞系統(tǒng)的影響，發(fā)現HIV和HCV單感染及共感染均可造成體內的pDC細胞處于一定的激活狀態(tài)，但HIV單感染可損害pDC的TLR-9通路的體外激活，進而損害pDC-NK細胞相互作用，而HCV單感染則增強了pDC的TLR-9通路的體外激活，進而影響到pDC-NK細胞間的相互作用。在HIV/HCV共感染條件下，pDC-NK細胞系統(tǒng)的體外激活類似于HCV單感染，HIV/HCV共感染也能促進pDC經TLR-9途徑激活，進而影響到