Neurexophilin1在畢赤酵母中的表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物對雞精子的影響.pdf

1、母禽輸卵管存在一種特殊的管狀腺，因其具有貯存精子的功能，故稱貯精腺，貯精腺的微環(huán)境有利于精子保存，因此自然交配或人工授精后精子在此可長時間存活并保持受精能力。Neurexophilin1(nxph1)是貯精腺中存在的差異表達(dá)基因，因此本論文研究NXPH1蛋白在雞生殖道內(nèi)的表達(dá)，用畢赤酵母表達(dá)nxph1基因，并研究該真核表達(dá)產(chǎn)物對雞成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液環(huán)境和精子穿孔數(shù)的影響。
　　采用免疫組織化學(xué)方法研究產(chǎn)蛋期母雞和性成熟公雞生殖道內(nèi)N

2、XPH1的分布，發(fā)現(xiàn)NXPH1僅在公雞附睪近端輸出管表達(dá)，NXPH1在整個母雞輸卵管的漏斗部、膨大部、峽部、子宮部、子宮陰道交接部表達(dá)，且在漏斗部表達(dá)的陽性信號最強(qiáng)。
　　根據(jù)雞nxph1的序列，結(jié)合畢赤酵母密碼子的偏好性，合成nxph1基因，設(shè)計引物以合成基因為模板，擴(kuò)增其去除信號肽的DNA序列，將合成的nxph1基因及去除信號肽的△nxph1基因分別插入pPICZαA真核表達(dá)載體，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA/nxph1和去

3、除信號肽的重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA/△nxph1，電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115。陽性重組質(zhì)粒每隔24h添加1％濃度的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳和Western Blot檢測目的蛋白，大小約29kD。
　　體外培養(yǎng)雞成纖維細(xì)胞，細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果表明NXPH1蛋白在雞成纖維細(xì)胞中表達(dá)，將酵母表達(dá)的NXPH1和△NXPH1蛋白加入到雞成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中，檢測細(xì)胞培養(yǎng)中液Ca2+、pH值、酸性磷酸酶、碳酸酐酶的變化，結(jié)果表明加入