繩狀青霉耐酸分子機制研究.pdf

1、自然界中，各種極端環(huán)境下均有生物體存在，如高溫、強酸堿性條件、鹽度、高壓及輻射條件。生存在極端環(huán)境下的生物稱為極端微生物。各種微生物適應(yīng)極端環(huán)境的機制為研究大多數(shù)物種在其生物進程中的基本特征提供了獨特的視角。嗜酸微生物是指能夠在pH1.0下生長，且在pH小于4.0時活躍生長的微生物，其耐酸的相關(guān)機制尚不清楚。
　　本論文進行了繩狀青霉X33耐酸分子機制的探索。分離得到一株耐酸的繩狀青霉X33，該菌具有廣泛的生長pH范圍，為pH0.

2、6-13.0。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法建立了繩狀青霉X33轉(zhuǎn)化系統(tǒng)并進行了優(yōu)化，構(gòu)建了T-DNA插入突變體庫。針對轉(zhuǎn)化過程中4個關(guān)鍵因素，即繩狀青霉X33孢子的新鮮程度、預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基和共培養(yǎng)培養(yǎng)基中AS的有無以及濃度、共培養(yǎng)時間、繩狀青霉X33孢子懸液和農(nóng)桿菌菌液的比例，對農(nóng)桿菌介導(dǎo)繩狀青霉X33轉(zhuǎn)化效率的影響建立了高效的生長青霉轉(zhuǎn)化體系。利用該轉(zhuǎn)化系統(tǒng)構(gòu)建了含有9300株轉(zhuǎn)化子的突變體庫，Southern雜交顯示轉(zhuǎn)化子基因組中，T-DN

3、A插入拷貝數(shù)為1-2個，其中87.7％為隨機單拷貝插入。對繩狀青霉X33 T-DNA插入突變體庫進行表型篩選，發(fā)現(xiàn)了幾株形態(tài)異常的突變子。
　　以不耐酸突變體M4為研究對象，利用TAIL-PCR技術(shù)，克隆得到一個基因，命名為PfMFS（基因號:KF815490）。經(jīng)比對，該基因與馬爾尼菲青霉(Penicillium marneffeiATCC18224)保守的假想蛋白(XP_002144911)具有88％的同源性。它包含一個165

4、6bp的開放閱讀框ORF，編碼551個氨基酸。BLASTP分析顯示，該基因編碼的氨基酸是主要協(xié)助轉(zhuǎn)運蛋白超家族(MFS)成員。這些結(jié)果顯示，該假想蛋白是一種新的MFS轉(zhuǎn)運體，但是其功能尚不清楚。
　　序列分析可知，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化過程中T-DNA插入在PfMFS基因的啟動子區(qū)-372。為了進一步確定PfMFS基因在繩狀青霉X33耐酸性狀中的作用，為此我們采用以同源重組為基礎(chǔ)的基因敲除技術(shù)，利用農(nóng)桿菌侵染的轉(zhuǎn)化方法將野生菌的PfMFS基因

5、敲掉，并通過Southern雜交和PCR進行了驗證。結(jié)果顯示PfMFS基因缺失突變株在pH1.0生長極為緩慢，進一步說明PfMFS基因在繩狀青霉X33耐酸性狀中發(fā)揮作用。
　　通過回補實驗，以質(zhì)粒p3SR2為骨架構(gòu)建了回補載體p3SR2-PfMFS，采用電擊轉(zhuǎn)化萌發(fā)孢子方法，將PfMFS基因重新導(dǎo)入敲除突變體M7，并用RT-PCR、Northern雜交等實驗進行驗證。該數(shù)據(jù)說明突變體M4和M7性狀的改變是PfMFS基因的作用。

6、r>　　為了測定繩狀青霉X33原生質(zhì)體體內(nèi)pH，制備了原生質(zhì)體，用高效熒光探針BCECF-AM進行測定。敲除突變體M7由于PfMFS基因被破壞，其原生質(zhì)體內(nèi)pH較野生菌低。這一結(jié)果顯示了PfMFS基因在維持繩狀青霉X33細胞內(nèi)pH穩(wěn)態(tài)的重要性。
　　為了進一步研究PfMFS基因的生物學(xué)功能，進行了異源表達實驗。酵母轉(zhuǎn)化子PfMFS-22在pH2.0的YPD培養(yǎng)基上的生長情況好于含空載的酵母，在pH1.0下都不生長，pH3.0生長幾

7、乎相同。結(jié)果說明，繩狀青霉X33 PfMFS基因在低pH下對酸性環(huán)境具有抵抗能力。
　　繩狀青霉X33敲除突變體M7對NaCl不敏感，野生菌在NaCl存在的情況下生長量增加。在原生質(zhì)體懸浮液pH的測定實驗，原生質(zhì)體懸浮液中加入25mM的NaCl，測其pH，結(jié)果顯示加入NaCl之后，野生菌的pH顯著降低，而敲除突變體幾乎不變。結(jié)果說明，Na+與PfMFS轉(zhuǎn)運體相關(guān)聯(lián)，PfMFS轉(zhuǎn)運體可能是一個Na+依賴性MFS運轉(zhuǎn)體。
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