產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌分子分型及傳播機(jī)制研究.pdf

1、肺炎克雷伯桿菌屬革蘭陰性桿菌，常存在于人體上呼吸道和腸道，當(dāng)機(jī)體抵抗力降低時可引起肺部感染、泌尿道感染、甚至血液感染等。肺炎克雷伯菌引起的醫(yī)院感染率近期逐年增高，已成為臨床分離及醫(yī)院感染的重要致病菌之一。碳青霉烯類抗生素是抗菌譜最廣，抗菌活性最強(qiáng)的一類β-內(nèi)酰胺抗生素，因其具有對β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定以及毒性低等特點，已經(jīng)成為治療嚴(yán)重細(xì)菌感染最主要的抗菌藥物之一。但是，隨著碳青霉烯類抗生素在臨床上使用的增加，碳青霉烯類抗生素的耐藥性也不斷增加

2、。近年來，碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaeeae，CRE)呈世界性流行，在我國流行情況也日益嚴(yán)重。其耐藥的重要機(jī)制就是細(xì)菌產(chǎn)生碳青霉烯酶(carbapenem hydrolyzingβ-lactamases，carbapenemases)。碳青霉烯酶是指能分解包括碳青霉烯類抗生素在內(nèi)的幾乎所有β內(nèi)酰胺類抗生素的一大類β內(nèi)酰胺酶，包括Ambler分子分類中的A類、B類、D

3、類3類酶[2，3]，其中A類酶大多數(shù)能被克拉維酸抑制，屬于Bush分類中的2f亞群，主要見于腸桿菌科細(xì)菌，近來也在非發(fā)酵菌中有報道。KPC(Klebsiella pneumoniae carbapenemase，KPC)型碳青霉烯酶屬于功能分類法的2f組，分子分類法的A類，是一種由質(zhì)粒介導(dǎo)的絲氨酸β-內(nèi)酰胺酶，以絲氨酸作為活性位點，是目前引起腸桿菌科細(xì)菌對碳青霉烯類耐藥的重要原因。
　　自2001年美國首次報道第一株產(chǎn)KPC酶肺炎

4、克雷伯菌后，產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌在全球范圍快速播散，且在世界各地多個醫(yī)院報道出現(xiàn)院內(nèi)爆發(fā)流行?，F(xiàn)已報道過產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌的國家橫跨美洲、歐洲和亞洲等十幾個國家和地區(qū)。此外，菌種也不再局限于肺炎克雷伯菌中，產(chǎn)KPC酶的其他腸桿菌科細(xì)菌日益增多，包括產(chǎn)酸克雷伯菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、腸炎沙門菌古巴血清型、弗勞地枸櫞酸桿菌、粘質(zhì)沙雷菌和奇異變形桿菌等，最近甚至還在銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌和鮑曼不動桿菌等非發(fā)酵細(xì)菌中也發(fā)

5、現(xiàn)了該酶。由于產(chǎn)KPC酶細(xì)菌對臨床應(yīng)用的青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類以及氨曲南等多種抗生素耐藥，以及常常同時攜帶有其他耐藥基因，因此多重耐藥菌株的不斷增加常導(dǎo)致臨床抗菌藥物治療的失敗和病程遷延，給臨床治療帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，KPC酶的快速傳播與其編碼基因定位在轉(zhuǎn)座子移動元件上密切相關(guān)，推測產(chǎn)KPC酶菌株在醫(yī)院范圍內(nèi)廣泛播散的機(jī)制主要通過水平傳播和克隆傳播兩種形式導(dǎo)致醫(yī)院感染暴發(fā)流行的發(fā)生。因此，急需成功有效的院內(nèi)感染控制措

6、施，以阻斷KPC酶的流行、減少患者的感染率，縮短住院時間和節(jié)約寶貴的醫(yī)療資源。
　　2007年，浙江省報道了全國第一例產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌，隨后產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌在浙江省及華東地區(qū)等省市快速蔓延，可能與東部地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)、醫(yī)療水平較高及抗生素的使用有關(guān)，給碳青霉烯類抗生素的使用及感染治療造成嚴(yán)重威脅。近來，產(chǎn)KPC酶菌株在全國也有逐漸增多的趨勢并在多個地方造成流行。
　　本研究收集了來自全國5個省份9個城市13家醫(yī)院95

7、株碳青霉烯類抗生素耐藥并且產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌，對這些菌株的耐藥性、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶及質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶基因型、同源性及分子分型和碳青霉烯酶編碼基因周圍序列進(jìn)行系統(tǒng)深入的研究，旨在闡明產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌的分子流行、耐藥特性和傳播機(jī)制，明確產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌株在我國主要流行的克隆分型和攜帶KPC酶編碼基因的轉(zhuǎn)座元件。研究內(nèi)容包括以下四部分。
　　1.碳青霉烯類抗生素耐藥肺炎克雷伯菌的耐藥性研究
　　

8、利用Etest法測定12種抗生素對95株肺炎克雷伯菌的最低抑菌濃度(MIC)。發(fā)現(xiàn)95株肺炎克雷伯菌對亞胺培南、美羅培南和厄他培南均顯示出從低到高度的耐藥性(MIC值為3->32 mg/L)；對頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢西丁、哌拉西林/三唑巴坦和頭孢哌酮/舒巴坦均產(chǎn)生很高的耐藥性；對環(huán)丙沙星和阿米卡星兩種抗生素卻顯示了不同程度的敏感和耐藥，MIC值分別在0.38->32和1->256 mg/L范圍內(nèi)變化。但是，這95株碳青霉烯類耐藥肺炎克

9、雷伯菌對多粘菌素和替加環(huán)素則均顯示了較好的敏感性，MIC值范圍≤2mg/L。
　　2.碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌同源性研究
　　利用脈沖場凝膠電泳(PFGE)技術(shù)和多位點序列分型(MLST)方法對95株碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌進(jìn)行同源性和分子分型研究。PFGE分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)95株肺炎克雷伯菌屬于9個流行克隆株。其中，B、C和E克隆是我國產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌主要流行的克隆，分別在杭州、寧波、南京、合肥等多家醫(yī)院流行。；ML

10、ST分型發(fā)現(xiàn)我國產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌的序列型共7個，分別是ST11、ST15、ST23、ST349、ST351、ST438和ST439，分布在浙江、上海、江蘇、安徽、河南等省市地區(qū)。在我國主要流行的序列型為ST11(61/95)，和歐美國家主要流行的ST258僅有一個管家基因(tonB)的差別，屬于同一個克隆復(fù)合體CC258，具有較近的親緣關(guān)系。同時發(fā)現(xiàn)有其他的序列型包括ST15和ST23等出現(xiàn)在同一家醫(yī)院或地區(qū)，呈現(xiàn)局部流行的態(tài)勢，

11、需引起我國醫(yī)院感染控制相關(guān)部門的高度重視。
　　本研究從95株肺炎克雷伯菌中挑選出14株分別代表不同ST型和不同地區(qū)的菌株，應(yīng)用質(zhì)粒抽提實驗、接合實驗、轉(zhuǎn)化實驗、Southern雜交等進(jìn)行質(zhì)粒同源性分析及碳青霉烯酶基因定位研究。這14株菌株中，編碼blaKPC基因的質(zhì)粒均可成功轉(zhuǎn)至受體菌，大小介于40-180kb之間，經(jīng)HindⅢ內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒表現(xiàn)出多樣性。MLST和PFGE分型結(jié)果一致，ST11的8株細(xì)菌的PFGE分型結(jié)果的相似

12、性>80％。
　　3.超廣譜β-內(nèi)酰胺酶及質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶基因型檢測
　　利用特異性引物，運(yùn)用PCR方法擴(kuò)增超廣譜β-內(nèi)酰胺酶及質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶編碼基因，包括blaCTX-M，blaTEM，blaSHV，blaVEB和6組質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶編碼基因(MOX，CIT，DHA，ACC，EBC，F(xiàn)OX)，并對PCR陽性產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)廣譜β-內(nèi)酰胺酶blaTEM-1出現(xiàn)在43株肺炎克雷伯菌中，而blaVEB

13、未在任何一株細(xì)菌中檢出。在61株序列型為ST11的菌株中，有38株細(xì)菌檢測到超廣譜β-內(nèi)酰胺酶編碼基因，包括blaCTX-M-3，blaCTX-M-14或blaSHV-12；5株細(xì)菌檢測到質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶編碼基因blaDHA-1；其中有3株細(xì)菌同時檢測到超廣譜β-內(nèi)酰胺酶及質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶編碼基因。此外，在32株序列型為ST15，ST23，ST349，ST351和ST439的菌株中，有9株細(xì)菌檢測到超廣譜β-內(nèi)酰胺酶編碼基因(b

14、laCTX-M-3，blaCTX-M-14或blaSHV-12)；17株細(xì)菌檢測到質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶編碼基因blaDHA-1；其中有4株細(xì)菌同時檢測到超廣譜β-內(nèi)酰胺酶及質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶編碼基因。但是，在2株序列型為ST438的菌株中，未檢測到任何超廣譜β-內(nèi)酰胺酶及質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶編碼基因。
　　4.KPC酶編碼基因周圍序列分析
　　利用一系列特異性引物，運(yùn)用PCR方法擴(kuò)增KPC酶編碼基因周圍序列，對PCR產(chǎn)物進(jìn)

15、行克隆測序。我國曾報道KPC基因位于一個由Tn3轉(zhuǎn)座子和Tn4401轉(zhuǎn)座子共同整合而成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)上，這一結(jié)構(gòu)包含Tn3轉(zhuǎn)座酶基因、Tn3熔解酶基因、插入序列ISKpn8，blaKPC-2編碼基因和部分ISKpn6序列。此外，我國產(chǎn)KPC酶細(xì)菌中KPC基因周圍結(jié)構(gòu)也存在兩種變異型，變異1型和變異2型。變異1型結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)在插入序列ISKpn8和blaKPC-2編碼基因之間出現(xiàn)一段不完整的blaTEM基因編碼序列；變異2型結(jié)構(gòu)則沒有發(fā)現(xiàn)Tn3轉(zhuǎn)

16、座酶基因和Tn3熔解酶基因編碼序列。本研究中95株肺炎克雷伯菌中KPC酶編碼基因序列與我國報道的該基因周圍結(jié)構(gòu)一致，僅有2070bp大小的結(jié)構(gòu)和國外報道相似，包括KPC基因和部分ISKpn6序列。有33株細(xì)菌與原始結(jié)構(gòu)一致，12株與變異1型結(jié)構(gòu)一致，50株與變異2型結(jié)構(gòu)一致。
　　結(jié)論：
　　1.碳青霉烯類抗生素耐藥肺炎克雷伯菌在體外藥敏實驗中，對多種抗生素耐藥率較高，對多粘菌素和替加環(huán)素顯示了較好的藥物敏感性，臨床可以綜合

17、考慮病人臨床表現(xiàn)及感染部位藥物富集濃度來進(jìn)行聯(lián)合治療。
　　2.我國產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌的主要流行的序列型為ST11，與世界流行的ST258同屬克隆復(fù)合體CC258，呈現(xiàn)世界范圍的大流行趨勢，需引起各國醫(yī)院感染控制相關(guān)部門的高度重視。
　　3.碳青霉烯酶KPC-2的產(chǎn)生是肺炎克雷伯菌對碳青霉烯耐藥的重要原因，同時攜帶多種耐藥基因，導(dǎo)致臨床對多種抗生素耐藥。
　　4.我國產(chǎn)KPC酶菌株中KPC編碼基因周圍這種由2個轉(zhuǎn)座