產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶弗勞地檸檬酸桿菌的研究.pdf

1、目的：
　　 碳青霉烯類抗生素是治療產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)和AmpC酶腸桿菌科細菌引起的嚴重感染的一線藥物。近年來，腸桿菌科細菌中發(fā)現(xiàn)一類新型的質(zhì)粒介導AmblerA類β-內(nèi)酰胺酶-肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KlebsiellapneumoniaeCarbapenemase，KPC)，是近10年來最常見的碳青霉烯酶之一。該酶能夠水解碳青霉烯類抗生素，造成對包括亞胺培南、美羅培南在內(nèi)的所有β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥，而且對相當一

2、部分非β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥。本文擬通過篩選出對亞胺培南耐藥或敏感性下降的腸桿菌科細菌并檢測相關(guān)耐藥基因，以期了解近年來本地區(qū)產(chǎn)KPC腸桿菌科細菌的分布狀況；對KPC型碳青霉烯酶基因在菌株間的轉(zhuǎn)移機制進行分析，研究KPC型碳青霉烯酶基因的播散機制。
　　 方法：
　　 應(yīng)用VITEK-60型全自動微生物分析儀對亞胺培南耐藥或敏感性下降的腸桿菌科細菌初次分離株進行鑒定和藥敏試驗。PCR擴增及測序檢測亞胺培南耐藥或敏感性下降的

3、腸桿菌科細菌KPC基因，對KPC陽性菌進行AmpC酶頭孢西丁三維試驗、ESBLs檢測、金屬酶初篩試驗、等電聚焦及PCR擴增測序(AmpC酶、ESBLs和金屬酶)相關(guān)基因，分析確定KPC陽性菌產(chǎn)生的所有β-內(nèi)酰胺酶的類型。接合轉(zhuǎn)化試驗和Southernblot試驗驗證blaKPC是否位于質(zhì)粒上以及質(zhì)粒是否可接合轉(zhuǎn)移。采用Etest法檢測KPC陽性菌、接合子或轉(zhuǎn)化子菌MIC值。對編碼blaKPC的質(zhì)粒測序并分析其周圍序列。
　　 結(jié)

4、果：
　　 1．菌株篩選和藥敏結(jié)果：分離到一株攜帶KPC型碳青霉烯酶基因弗勞地檸檬酸桿菌，弗勞地檸檬酸桿菌對亞胺培南及頭孢菌素類抗生素均呈現(xiàn)高水平耐藥，對美羅培南為中介耐藥，對氨曲南、氨芐西林和復(fù)方磺胺甲噁唑耐藥且MICs均＞256μg/ml，但轉(zhuǎn)化子對亞胺培南及頭孢菌素類抗生素呈現(xiàn)敏感性下降，氨芐西林在轉(zhuǎn)化子中的MICs仍為＞256μg/ml。
　　 2．β-內(nèi)酰胺酶檢測：弗勞地檸檬酸桿菌金屬酶初篩結(jié)果為陰性；經(jīng)頭孢噻

5、肟和頭孢噻肟/克拉維酸雙紙片協(xié)同法檢測，弗勞地檸檬酸桿菌產(chǎn)ESBLs；頭孢西丁三維試驗陽性(即AmpC酶陽性)；通過等電聚焦電泳發(fā)現(xiàn)弗勞地檸檬酸桿菌含有等電點為5.4和6.7的β-內(nèi)酰胺酶條帶，推測pI5.4的為TEM-1型β-內(nèi)酰胺酶和pI6.7的為KPC-2型碳青霉烯酶，但沒有發(fā)現(xiàn)其它β-內(nèi)酰胺酶條帶。
　　 3．耐藥基因檢測：經(jīng)PCR檢測，弗勞地檸檬酸桿菌中KPC型碳青霉烯酶基因陽性，經(jīng)測序與GenBank序號EF0625

6、08的序列一致，為blaKPC-2；ESBLs基因PCR檢測及測序發(fā)現(xiàn)弗勞地檸檬酸桿菌攜帶blaTEM-1和blaCTX-M-3；AmpC酶基因PCR檢測及測序判斷弗勞地檸檬酸桿菌攜帶染色體AmpC基因；未檢測到IPM型和VIM型金屬酶基因。
　　 4．接合轉(zhuǎn)化試驗：經(jīng)反復(fù)試驗，未得到接合子。將從原始菌株抽提的質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入受體菌中，經(jīng)亞胺培南篩選獲得轉(zhuǎn)化子，經(jīng)PCR和DNA測序，證實blaKPC-2、blaTEM-1和bl

7、aCTX-M-3基因陽性，但未檢測到AmpC酶基因。
　　 5．質(zhì)粒譜分析：質(zhì)粒電泳顯示，臨床分離菌含有3個質(zhì)粒，分別約為50kb、4kb和2.5kb，轉(zhuǎn)化子含1個質(zhì)粒，約為50kb。
　　 6．KPC-2型碳青霉烯酶基因定位及周圍序列分析：Southernblot證實臨床分離株和轉(zhuǎn)化子的50kb質(zhì)粒上顯示blaKPC-2特異性DNA探針雜交信號，大腸埃希菌V517質(zhì)粒上沒出現(xiàn)檢測信號，染色體碎片上出現(xiàn)弱檢測信號。bla

8、KPC-2基因周圍序列中含有多個轉(zhuǎn)座相關(guān)元件，在blaKPC-2和blaTEM-1的上游有ISKpn8轉(zhuǎn)座酶基因和一個由tnpR+tnpA構(gòu)成的Tn3樣轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)，在blaKPC-2和blaTEM-1下游有一個ISKpn6-樣轉(zhuǎn)座酶基因。
　　 結(jié)論：
　　 首次在溫州地區(qū)分離到一株產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶的弗勞地檸檬酸桿菌，在菌株中檢出blaKPC-2、blaTEM-1、blaCTX-M-3和AmpC基因，blaTEM