羊源弗氏檸檬酸桿菌Ⅰ型菌毛FimA和FimH蛋白免疫原性分析.pdf

1、弗氏檸檬酸桿菌是一種典型的人-畜-魚共患條件性致病菌。近年來(lái)，弗氏檸檬酸桿菌引起動(dòng)物和人發(fā)病的報(bào)道較多，且常引起較嚴(yán)重的感染。黏附是病原微生物建立感染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，理論上阻斷其黏附就可阻斷病原菌對(duì)宿主的感染，從而達(dá)到預(yù)防的作用。為了探討弗氏檸檬酸桿菌及其黏附素作為疫苗成分的免疫效力，本研究以弗氏檸檬酸桿菌及其Ⅰ型菌毛為研究對(duì)象，對(duì)其Ⅰ型菌毛相關(guān)基因的重組表達(dá)、羔羊感染模型、小鼠免疫保護(hù)效力、羔羊免疫保護(hù)效力等進(jìn)行了系統(tǒng)研究，為該病抗體 E

2、LISA快速檢測(cè)方法的建立和新型疫苗的研制與開發(fā)奠定基礎(chǔ)。具體研究?jī)?nèi)容以下：
　?。?）Ⅰ型菌毛黏附素 FimA和 FimH蛋白表達(dá)純化。參照 GenBank登錄號(hào)AJ508060.1上收錄的弗氏檸檬酸桿菌FimA和FimH全基因核苷酸序列，分別設(shè)計(jì)合成兩對(duì)引物，以弗氏檸檬酸桿菌總 DNA為模板，PCR擴(kuò)增 FimA和 FimH基因，其片段大小分別為552bp和1005bp。將FimA和FimH基因分別插入原核表達(dá)載體 pET-2

3、8a(+)質(zhì)粒，并成功構(gòu)建了兩個(gè)重組表達(dá)載體并將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、SDS-PAGE分析和Western blotting鑒定，結(jié)果表明：FimA和 FimH蛋白均以包涵體的形式表達(dá)，分子量約為19 kDa和38 kDa。重組后的FimA和FimH蛋白均能被兔抗弗氏檸檬酸桿菌陽(yáng)性血清特異性識(shí)別，表明兩者均具有較好的反應(yīng)原性。利用包涵體蛋白純化試劑盒對(duì)重組蛋白進(jìn)行提取后獲得了純化的重組蛋白。該試驗(yàn)為將

4、FimA和 FimH重組蛋白的進(jìn)一步開發(fā)為診斷試劑抗原或亞單位疫苗抗原奠定基礎(chǔ)。
　　（2）亞單位疫苗及蛋白與滅活菌體混合苗的小鼠免疫保護(hù)力評(píng)價(jià)。制備弗氏佐劑 FimA和 FimH亞單位疫苗及各蛋白與滅活菌體的混合疫苗。SPF級(jí)BALB/c小鼠免疫劑量為200μL/只，蛋白含量30μg/只。小鼠免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)照組小鼠全部死亡；FimA、FimH和 FimA+FimH蛋白苗分別提供了10％（1/10）、20%（2/10）和4

5、0%（4/10）的保護(hù)率;滅活疫苗及蛋白與滅活菌體混合苗均可提供100%（10/10）的保護(hù)率。小鼠二次免疫后，經(jīng) ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)，結(jié)果顯示 FimA、FimH或 FimA+FimH蛋白苗可誘導(dǎo)不同程度的抗體水平，且與滅活菌體聯(lián)用作為抗原時(shí)還可增強(qiáng)滅活疫苗誘導(dǎo)抗體水平的能力。該研究在小鼠免疫保護(hù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上證實(shí)弗氏檸檬酸的菌體滅活疫苗具有良好保護(hù)效力，重組 FimA和 FimH蛋白也均有一定的免疫保護(hù)效力。
　?。?）弗氏

6、檸檬酸桿菌小尾寒羊感染模型的建立。將3-4月齡健康小尾寒羊6只，隨機(jī)均分為3組（2只/組）。第1-3組分別按照3.0×109、1.0×109、3.3×108 CFU/只的劑量通過(guò)耳靜脈注射弗氏檸檬酸桿菌 LK-1株菌液。結(jié)果表明，在14日的觀察期內(nèi)，第1組2只全部死亡，第2組2只死亡1只，第3組沒(méi)有發(fā)生死亡；表明弗氏檸檬酸桿菌 LK-1株對(duì)小尾寒羊的靜脈致死劑量介于1.0-3.0×109CFU之間。死亡羊只進(jìn)行剖檢，可見(jiàn)以各器官出血為特

7、征的典型敗血癥性病理變化，與臨床上自然發(fā)病羊的癥狀類似。其主要表現(xiàn)在肺臟、脾臟嚴(yán)重出血，腦組織輕度水腫、腹腔積液和心肌腫大出血等。弗氏檸檬酸桿菌羔羊感染模型的建立為進(jìn)一步開展其致病機(jī)理研究、疫苗的效力檢測(cè)等奠定基礎(chǔ)。
　　（4）亞單位疫苗及蛋白與滅活菌體混合苗的羊免疫保護(hù)效力評(píng)價(jià)。根據(jù)MontanideTMGEL01 PR水溶性佐劑產(chǎn)品的說(shuō)明書，分別制備含有GEL佐劑的3種弗氏檸檬酸桿菌疫苗： LK-1株滅活菌體疫苗、“FimA+

8、FimH蛋白疫苗”、“FimA蛋白+FimH蛋白+LK-1株滅活菌體疫苗”，將3種疫苗分別通過(guò)肌肉注射2次免疫（間隔21日）羔羊，然后使用致死劑量的弗氏檸檬酸桿菌菌液1.5 mL（含有活菌數(shù)為2.43×109 CFU）進(jìn)行耳靜脈攻毒。結(jié)果表明，“FimA+FimH蛋白疫苗”可提供25%（1/4）的保護(hù)率， LK-1株滅活菌體疫苗可提供100%（4/4）的保護(hù)率，“FimA蛋白+FimH蛋白+滅活菌體疫苗”也可提供100%（4/4）的保護(hù)