大鯢源弗氏檸檬酸桿菌的分離鑒定、敏感藥物篩選及耐藥性分析.pdf

1、近年來，大鯢疾病頻發(fā)，為了確定重慶某大鯢養(yǎng)殖場患病大鯢的病原菌，并進(jìn)行菌種鑒定及胞外酶活性研究，從具有典型癥狀的病鯢肝臟分離出一株菌株TNL12，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性以及16S rDNA分析對菌株進(jìn)行種類鑒定，通過人工感染試驗(yàn)確定病原菌株的致病性，利用平板法檢測胞外酶活性。結(jié)果顯示，所獲菌株為革蘭氏陰性短桿菌，無芽孢，其生理生化特性與弗氏檸檬酸桿菌一致。16SrDNA分析表明，TNL12與弗氏檸檬酸桿菌的同源性為99％，在系統(tǒng)發(fā)

2、育樹與弗氏檸檬酸桿菌聚為一支。該病原菌可引起健康青蛙、大鯢出現(xiàn)感染癥狀，且感染癥狀與自然發(fā)病癥狀相似。胞外酶活性檢測發(fā)現(xiàn)該菌可產(chǎn)卵磷脂酶、淀粉酶，但不產(chǎn)脂酶、蛋白酶、明膠酶、脲酶等胞外酶。這些研究結(jié)果表明，從患病大鯢中分離出的病原菌為弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacterfreundii），且對大鯢有較強(qiáng)的致病性。
　　在大鯢病害防治的過程中，由于抗生素的不合理使用，使許多病原菌對抗生素產(chǎn)生了一定的抗性，為研究有效防治大鯢疾病的方

3、法，采用紙片擴(kuò)散法研究所分離的病原菌對20種抗生素的敏感性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本次分離的病原菌TNL12為弗氏檸檬酸桿菌，對林可霉素類抗生素、四環(huán)素類抗生素、磺胺類抗生素有一定的耐藥作用，而對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、β-內(nèi)酰胺類抗生素以及喹諾酮類抗生素則產(chǎn)生完全耐藥性。為探索該病原菌的耐藥機(jī)制，設(shè)計(jì)一系列引物對相關(guān)耐藥基因進(jìn)行檢查，得出該弗氏檸檬酸桿菌中攜帶有耐大環(huán)內(nèi)酯類抗生素基因MsrD以及耐β-內(nèi)酰胺類抗生素基因Tem，盡管該細(xì)菌對喹諾酮類抗

4、生素藥物高度不敏感，但并未檢測到相關(guān)的耐藥基因，可能與核糖體突變有關(guān)。
　　針對大鯢所患疾病，采用瓊脂擴(kuò)散法（平板打孔法）測定五味子等45種中草藥對大鯢源弗氏檸檬酸桿菌的體外抑菌效果，并用二倍稀釋法測定抑菌效果良好的25種中草藥對該病原菌的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:來源于病鯢肝臟的弗氏檸檬酸桿菌對五味子及烏梅高度敏感，對金銀花、黃連、丁香等7種中草藥中度敏感，對牡丹皮、杜仲等16中草藥敏感性較弱