三疣梭子蟹病原弗氏檸檬酸桿菌的分離鑒定、檢測及防控研究.pdf

1、三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)又稱梭子蟹、槍蟹、海螃蟹,隸屬甲殼綱(Crustacea),十足目(decapoda),梭子蟹科(Portunidae),梭子蟹屬(Portunus),在我國主要集中于山東和江浙沿海海域,是一種食用與藥用價值較高的大型海產(chǎn)經(jīng)濟蟹類。然而近年來海洋環(huán)境受到污染,生態(tài)環(huán)境不斷惡化,隨著梭子蟹的養(yǎng)殖規(guī)模的逐漸增大,各種病害開始接踵而來,并呈現(xiàn)大規(guī)模暴發(fā)和流行的趨勢,特別是細(xì)菌性疾病

2、,給三疣梭子蟹養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。為了進一步弄清導(dǎo)致養(yǎng)殖梭子蟹死亡的病因及其致病機理,并找到有效的檢測手段和防治方法,本文以具有典型病癥的病蟹作為材料,通過對病原的分離鑒定、人工回感試驗、組織病理觀察并結(jié)合常規(guī)的生理生化反應(yīng)特性及分子生物學(xué)特性,對梭子蟹的病原進行了初步研究；同時建立了病原菌的分子生物學(xué)檢測方法,篩選了防治藥物,以期為梭子蟹細(xì)菌性疾病的早期診斷及防治提供科學(xué)的參考依據(jù)。
　　 2009～2010年在江蘇省

3、連云港市贛榆等地養(yǎng)殖的梭子蟹出現(xiàn)大量死亡,病蟹主要癥狀為蟹體消瘦,不攝食、行動緩慢,嚴(yán)重者浮出水面或爬在池邊,對外界的刺激反應(yīng)遲鈍；掀開頭胸甲可見肝胰腺、肌肉組織水腫,并有大量渾濁的積液,嚴(yán)重者肌肉糜爛并伴有腐臭的氣味。從瀕死的梭子蟹體內(nèi)無菌操作分離得到兩株優(yōu)勢菌。人工感染試驗表明所分離的菌株JG091120-1對三疣梭子蟹、日本蟳(Charybdis japonica)、中國對蝦(Penaeus chinensis)均有明顯的致病作用

4、,而另一株菌JG091120-2無致病作用,由此表明菌JG091120-1為本次梭子蟹的致病菌。通過菌體觀察、培養(yǎng)特性及生理生化鑒定并結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育學(xué)等分子手段,鑒定該菌為弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)。弗氏檸檬酸桿菌隸屬腸桿菌科(Enterobacteriaceae)枸櫞酸桿菌屬(Citrobacter)。該菌革蘭氏陰性,需氧或兼性厭氧,為條件致病菌,廣泛分布于自然界中,是人和動物(哺乳類、鳥類、爬行類及兩棲

5、類)腸道內(nèi)正常的菌群。該菌可導(dǎo)致河蟹、烏鱧、紅螯螯蝦、尼羅羅非魚等水產(chǎn)動物暴發(fā)疾病。藥物敏感性試驗結(jié)果表明,該致病菌對氟羅沙星、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、依諾沙星、氧氟沙星、左氟沙星等7種抗生素高度敏感。
　　 運用石蠟包埋及組織切片技術(shù)對患病梭子蟹的鰓、肝胰腺、螯足肌肉、腸道、心肌等組織進行了病理學(xué)研究,同時對其致病機理進行了初步分析。其病癥主要表現(xiàn)為:肌細(xì)胞破損、壞死,部分細(xì)胞細(xì)胞核出現(xiàn)萎縮或腫脹,血細(xì)胞凝集,肝胰腺細(xì)胞

6、嚴(yán)重壞死。
　　 進行了病原弗氏檸檬酸桿菌防治藥物的篩選工作,選擇市場中常用漁用抗生素及中草藥進行藥敏試驗,結(jié)果表明抑菌凈、恩諾沙星、氟哌酸、復(fù)方磺胺甲噁唑、蘇木、五倍子、五味子、大黃、黃柏、黃連等抗菌效果十分顯著。
　　 本論文基于定居因子抗原cfa基因序列設(shè)計了1對引物,建立了一種弗氏檸檬酸桿菌快速、準(zhǔn)確的PCR檢測方法,敏感性檢測結(jié)果顯示,該PCR方法最低能檢測6.47×103CFU/mL菌體濃度的弗氏檸檬酸桿菌,