長雙歧桿菌和短雙歧桿菌的耐酸機(jī)制研究.pdf

1、雙歧桿菌是定植于人體及動(dòng)物腸道的重要菌群。作為重要的益生菌，對(duì)人體具有多種潛在的益生功能，因而廣泛應(yīng)用于乳制品等益生產(chǎn)品中。通常情況下，當(dāng)人體攝入雙歧桿菌后，人體腸道中的雙歧桿菌必須達(dá)到足夠的活菌數(shù)目才能有效地發(fā)揮其益生功能。然而，酸性條件（如雙歧桿菌應(yīng)用于發(fā)酵乳制品中的低pH值、自身發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的酸性物質(zhì)乳酸和乙酸等造成的低 pH發(fā)酵液、人體胃液中的低pH值等）常常導(dǎo)致雙歧桿菌的活菌數(shù)目大大降低，從而很難到達(dá)人體腸道發(fā)揮作用時(shí)所要

2、求的活菌數(shù)目。因而，強(qiáng)的耐酸性被認(rèn)為是雙歧桿菌作為潛在可應(yīng)用益生菌的重要優(yōu)良性狀之一。但是，大多數(shù)的雙歧桿菌的耐酸性極差，從而極大地限制了其在益生產(chǎn)品中的應(yīng)用。因此，提高雙歧桿菌的耐酸性則顯得非常重要，這將有助于雙歧桿菌有效地發(fā)揮其益生功能進(jìn)而廣泛地應(yīng)用于益生產(chǎn)品中。
　　為了提高雙歧桿菌的酸耐受性，非常有必要對(duì)雙歧桿菌的耐酸機(jī)制進(jìn)行全面深入的了解。然而，到目前為止，關(guān)于雙歧桿菌耐酸機(jī)制研究還只是處于起步階段，其耐酸性機(jī)理仍不清楚

3、。
　　本課題從一株長雙歧桿菌原始菌株（Bifidobacterium longum JDY1017）和一株短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve BB8）原始菌株出發(fā)，篩選原始菌株的耐酸菌株；在細(xì)胞膜水平上對(duì)兩株耐酸菌株和其相應(yīng)的原始菌株進(jìn)行了比較研究，探索細(xì)胞膜在雙歧桿菌耐酸性中具有的重要作用；同時(shí)結(jié)合 RNA-seq測(cè)序技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR和生理學(xué)分析等方法，對(duì)短雙歧桿菌耐酸菌株（B. breve BB

4、8dpH）和其原始菌株作了比較研究，旨在從轉(zhuǎn)錄組水平和生理特性方面解析短雙歧桿菌的耐酸機(jī)理；此外，結(jié)合SDS-PAGE和LC-MS/MS技術(shù)等，對(duì)兩株雙歧桿菌（長雙歧桿菌B. longum JDY1017和短雙歧桿菌B. breve BB8）原始菌株和其相應(yīng)的耐酸菌株膜相關(guān)蛋白作了比較研究，探討了膜相關(guān)蛋白在雙歧桿菌耐酸性中的作用，從而對(duì)雙歧桿菌耐酸機(jī)理提供更全面深入的理解，為提高雙歧桿菌耐酸性及增強(qiáng)其在益生產(chǎn)品中應(yīng)用穩(wěn)定性提供新的策略

5、和理論依據(jù)。
　　本研究中，將一株長雙歧桿菌（B. longum JDY1017）和一株短雙歧桿菌（B. breve BB8）原始菌株長時(shí)間暴露于酸性條件，反復(fù)篩選原始菌株相應(yīng)的耐酸菌株，最終篩選獲得了一株長雙歧桿菌耐酸菌株和一株短雙歧桿菌耐酸菌株，其分別命名為Bifidobacterium longum JDY1017dpH和Bifidobacterium breve BB8dpH。通過對(duì)耐酸菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)20天，于每天培養(yǎng)后

6、對(duì)兩株耐酸菌株和其原始菌株進(jìn)行耐酸性分析，結(jié)果表明每天培養(yǎng)后兩株耐酸菌株在酸性環(huán)境下的存活率明顯高于其相應(yīng)的原始菌株，表明兩株耐酸菌株的耐酸表型具有遺傳穩(wěn)定性。
　　本研究中，在以有無吐溫-80的MRSC液體培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，比較分析兩株耐酸菌株和其相應(yīng)原始菌株耐酸性、細(xì)胞膜脂肪酸組成、細(xì)胞膜流動(dòng)性以及編碼環(huán)丙烷脂肪合成酶cfa基因表達(dá)。結(jié)果顯示：在以含吐溫-80的MRSC液體培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，兩株雙歧桿菌耐酸菌株相對(duì)其原始菌株的耐酸性增

7、加倍數(shù)（約為104-105倍）顯著高于在不含吐溫-80的MRSC液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)的耐酸性增加倍數(shù)（181和245倍）；在以含吐溫-80的MRSC液體培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，相對(duì)原始菌株，兩株耐酸菌株具有更長的脂肪酸平均碳鏈長度、更高的C18:1脂肪酸和環(huán)丙烷脂肪酸cycC19:0含量、更高的cfa基因表達(dá)水平以及更低的細(xì)胞膜流動(dòng)性；在以不含吐溫-80的MRSC液體培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，兩株耐酸菌株和其相應(yīng)原始菌株在脂肪酸組成、cfa基因表達(dá)、細(xì)胞膜流動(dòng)

8、性上無顯著差異。這些結(jié)果暗示，在以含吐溫-80的MRSC液體培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，兩株耐酸菌株相對(duì)其原始菌株耐酸性顯著的增強(qiáng)可能主要?dú)w因于其細(xì)胞膜的顯著變化。
　　綜合運(yùn)用RNA-seq測(cè)序、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和生理學(xué)分析等手段，在以標(biāo)準(zhǔn) MRSC液體培養(yǎng)基（含吐溫-80）培養(yǎng)時(shí)，對(duì)短雙歧桿菌耐酸菌株（B. breve BB8dpH）相對(duì)于其原始菌株具有更強(qiáng)耐酸性的相關(guān)機(jī)理作了系統(tǒng)的研究。RNA-seq測(cè)序結(jié)果顯示，相對(duì)原始菌株（B. b

9、reve BB8），短雙歧桿菌耐酸菌株（B. breve BB8dpH）中121個(gè)基因表達(dá)上調(diào)了2倍以上，146個(gè)基因表達(dá)下調(diào)了2倍以上；為了驗(yàn)證RNA-seq測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，選取了RNA-seq得到的27個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。結(jié)果表明：實(shí)時(shí)熒光定量PCR和RNA-seq 結(jié)果之間存在顯著的正相關(guān)性（R2=0.91），證明RNA-seq結(jié)果具有可靠的準(zhǔn)確性。耐酸菌株和原始菌株之間差異表達(dá)基因結(jié)果表明，短雙

10、歧桿菌耐酸菌株（B. breve BB8dpH）低表達(dá)支鏈脂肪酸合成前體物質(zhì)支鏈氨基酸的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因，暗示了短雙歧桿菌耐酸菌株（B. breve BB8dpH）可能通過降低細(xì)胞膜支鏈脂肪酸的合成，從而導(dǎo)致其具有更低的細(xì)胞膜流動(dòng)性以應(yīng)對(duì)不利酸性環(huán)境。此結(jié)果從基因表達(dá)角度支持了在含吐溫-80的MRSC液體培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，短雙歧桿菌耐酸菌株（B. breve BB8dpH）具有比其原始菌株（B. breve BB8）更低的細(xì)胞膜流動(dòng)性；此

11、外，短雙歧桿菌耐酸菌株（B. breve BB8dpH）高表達(dá)細(xì)胞外被組分（細(xì)胞壁肽聚糖、胞外多糖）合成相關(guān)基因，暗示了短雙歧桿菌耐酸菌株（B. breve BB8dpH）可能增強(qiáng)細(xì)胞外被（肽聚糖、胞外多糖）阻止氫離子進(jìn)入細(xì)胞的能力；短雙歧桿菌耐酸菌株（B. breve BB8dpH）高表達(dá)碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝、谷氨酸和谷氨酰胺合成及轉(zhuǎn)運(yùn)、組氨酸合成相關(guān)基因，暗示了短雙歧桿菌耐酸菌株（B. breve BB8dpH）可能增強(qiáng)各種碳水化合

12、物的吸收能力、增加細(xì)胞內(nèi)谷氨酸、谷氨酰胺以及組氨酸的含量以應(yīng)對(duì)不利酸性環(huán)境。短雙歧桿菌耐酸菌株（B. breve BB8dpH）和原始菌株（B. breve BB8）生理學(xué)比較研究結(jié)果顯示：耐酸菌株胞外多糖含量顯著高于其原始菌株，H+-ATP酶活性顯著低于其原始菌株?；谶@些結(jié)果，我們提出了短雙歧桿菌耐酸菌株相對(duì)其原始菌株具有更強(qiáng)耐酸性的耐酸模型。
　　在以標(biāo)準(zhǔn)MRSC液體培養(yǎng)基（含吐溫-80）培養(yǎng)時(shí)，基于兩株耐酸菌株和其相應(yīng)的原

13、始菌株細(xì)胞膜相關(guān)蛋白比較研究探討了膜相關(guān)蛋白在雙歧桿菌耐酸性中的作用。結(jié)果顯示：長雙歧桿菌耐酸菌株（B. longum JDY1017dpH）和其原始菌株（B. longum JDY1017）差異膜相關(guān)蛋白為與谷胱甘肽代謝相關(guān)的氨肽酶N；短雙歧桿菌耐酸菌株（B. breve BB8dpH）和其原始菌株（B. breve BB8）差異膜相關(guān)蛋白分別與胞外多糖合成、寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)、谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)合成、糖原代謝相關(guān)。這些結(jié)果暗示，長雙歧桿菌耐

14、酸菌株B. longum JDY1017dpH可能通過調(diào)節(jié)與谷胱甘肽合成相關(guān)的氨肽酶N，從而使細(xì)胞內(nèi)積累更多的谷胱甘肽以應(yīng)對(duì)不利酸性環(huán)境；短雙歧桿菌耐酸菌株B. breve BB8dpH可能通過調(diào)節(jié)與胞外多糖合成相關(guān)的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶從而增加細(xì)胞胞外多糖的含量以應(yīng)對(duì)不利酸性環(huán)境，此結(jié)果從膜相關(guān)蛋白角度支持了在含吐溫-80的MRSC液體培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，短雙歧桿菌耐酸菌株B. breve BB8dpH具有其原始菌株B. breve更高的胞外多糖