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文檔簡介
1、細(xì)胞凋亡,由基因控制并能夠自主有序的死亡,具有一系列的形態(tài)學(xué)及生化特征,在細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖及壓力應(yīng)激等生命歷程上起著關(guān)鍵作用。氧壓能夠調(diào)節(jié)和控制細(xì)胞生存,由活性氧介導(dǎo)的高氧壓可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。家蠶作為鱗翅目昆蟲的模式生物,逐漸成為研究熱點,但對氧壓誘導(dǎo)家蠶細(xì)胞凋亡的研究尚處于初級階段,其相應(yīng)的凋亡途徑的研究目前還不清楚。本研究基于已報道的家蠶凋亡相關(guān)基因,與具有較強抗氧化防御系統(tǒng)的鱗翅目典型代表草地貪夜蛾細(xì)胞相比較,論證了活性氧介導(dǎo)
2、的高氧壓誘導(dǎo)家蠶細(xì)胞凋亡有線粒體信號通路的參與,這將為進(jìn)一步解析家蠶細(xì)胞凋亡的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本文主要研究結(jié)果如下:
1.活性氧誘導(dǎo)家蠶BmN-SWU1細(xì)胞凋亡模型的建立
用0.1μM、1μM、5μM及10μMH2O2分別處理BmN-SWU1與sf9細(xì)胞0-24h、0-12h,,采用MTT分析、DAPI染色、流式分析及TUNEL染色的方法分別檢測細(xì)胞的活力、形態(tài)、凋亡率及DNA斷裂。結(jié)果發(fā)現(xiàn):用1μM H2O2分別處理
3、兩種細(xì)胞24h、12h時,細(xì)胞致死率接近50%,且DNA發(fā)生了斷裂。隨著處理時間的延長,細(xì)胞呈現(xiàn)一系列的凋亡特征:細(xì)胞皺縮、胞質(zhì)凝聚、凋亡小體出現(xiàn),且細(xì)胞凋亡的發(fā)生對H2O2呈時間依賴性。綜上,1μMH2O2分別處理BmN-SWU1與sf9細(xì)胞24h、12h,是誘導(dǎo)兩種昆蟲細(xì)胞凋亡的最佳條件。
2.活性氧誘導(dǎo)家蠶BmN-SWU1細(xì)胞凋亡的內(nèi)源性線粒體途徑的研究
1μM H2O2分別處理BmN-SWU1與sf9細(xì)胞不同
4、時間,隨著時間延長,線粒體分布逐漸由均勻分布向簇狀、彌散狀分布轉(zhuǎn)化,表明H2O2影響兩種昆蟲細(xì)胞內(nèi)的線粒體分布;同時檢測到線粒體膜電位呈時間依賴性下降,流式結(jié)果還顯示在BmN-SWU1細(xì)胞中,8h與0h時的線粒體膜電位相比,無顯著性差異。與此同時,與H2O2誘導(dǎo)前相比,誘導(dǎo)后的細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)ROS與Ca2+水平也逐漸升高。qPCR分析表明:H2O2可通過上調(diào)BmDronc、Bmapaf-1、BmICE,BmEndoG、BmP53、BmDre
5、dd和下調(diào)BmBuffy,BmIAP基因的表達(dá),誘導(dǎo)BmN-SWU1細(xì)胞凋亡。免疫熒光和western-blot結(jié)果表明:H2O2可以促進(jìn)細(xì)胞色素C的表達(dá),并從線粒體向胞質(zhì)釋放,除此之外,還可上調(diào)P53和下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)。Caspase-9與3/7酶活性檢測結(jié)果顯示:H2O2處理BmN-SWU1與sf9細(xì)胞不同時間后,其Caspase-9與Caspase-3/7酶活性升高。綜上,本研究論證了H2O2介導(dǎo)的氧壓誘導(dǎo)家蠶BmN-SW
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