活性氧在藍萼甲素誘導的HL-60細胞凋亡中的作用研究.pdf

1、背景與目的:藍萼香茶菜(Rabdosia japonica(Burm.f.)Haravar.glaucocalyx(Maxim.)Hara)為唇形科(Labiatae)香茶菜屬植物,具有健胃、清熱解毒、活血、抗菌消炎等活性,用于治療胃炎,脘腹脹痛,肝炎初期,感冒發(fā)熱,乳腺炎、關節(jié)痛等疾病。近年來,大量文獻報道香茶菜屬植物普遍具有抗腫瘤活性,貝殼杉烷形二萜類化合物是其活性成分。但藍萼香茶菜抗腫瘤活性研究卻鮮有報道。本文從體外水平研究了藍萼

2、香茶菜的主要二萜成分藍萼甲素(glaucocalyxin A；GLA)和藍萼丙素(glaucocalyxin C;GLC)的抗腫瘤作用。運用多種方法檢測GLA和GLC誘導的凋亡,并對細胞凋亡的機制以及活性氧(reactive oxygen species；ROS)在GLA誘導HL-60細胞凋亡中的作用進行了深入研究。目前,中醫(yī)藥研究的發(fā)展趨勢為采用分子生物學手段對祖國傳統(tǒng)醫(yī)學寶庫中的中草藥進行研究,對其藥理作用機制給予新的解釋,開發(fā)出新

3、的抗腫瘤藥物,弘揚祖國傳統(tǒng)醫(yī)學。在這樣的前提下,深入探討藍萼甲素的抗腫瘤作用分子機制,是一項很有前景和研究價值的課題。
　　 方法:首先運用MTT法比較了GLA和GLC的細胞毒作用。此外,我們運用分子對接(autodock)技術,以Bc1-2為靶蛋白,考察GLA或GLC與其結(jié)合能力；分別采用AO/EB雙染、DAPI染色、TUNEL法、DNA梯狀電泳法和AnnexinV-FITC/PI雙染方法,從細胞核形態(tài),生化指標的變化檢測細胞

4、凋亡,并且利用流式細胞儀定量了凋亡率。分光光度法檢測了caspase3、8和9的活性。流式細胞儀和熒光顯微鏡檢測了線粒體膜電位和ROS的爆發(fā)。氧電極法檢測了氧耗量,同時檢測了MDA的含量以及抗氧化酶(CAT和SOD)活性。免疫熒光法檢測了藍萼甲素對細胞色素C釋放的影響。免疫印跡法檢測了藍萼甲素對Bax和Bc1-2蛋白表達的影響。RT-PCR方法檢測了藍萼甲素對Fas基因表達的影響。同時利用MTT法,流式細胞儀及熒光顯微鏡檢測了抗氧化劑N

5、AC對藍萼甲素誘導HL-60細胞凋亡的影響。
　　 結(jié)果:GLA對所選擇的15個腫瘤細胞株均具有顯著的抗腫瘤活性,并呈現(xiàn)濃度依賴性效應,HL-60為其最敏感的細胞株,IC50僅為0.33μg/ml,而在所選的濃度下,GLC對15株腫瘤細胞均無作用。此外,分子對接(autodock)顯示,對接后GLA與Bc1-2蛋白的結(jié)合自由能和Ki值均低于GLC,說明GLA更易與Bc1-2結(jié)合從而抑制Bc1-2的功能,促進細胞凋亡。GLA可以誘

6、導HL-60細胞凋亡,凋亡細胞百分率從7.80％(0μg/ml)上升到40.60％(10μg/ml),具有濃度依賴性效應,但是GLC對HL-60細胞沒有作用。GLA可以導致HL-60細胞MMP下降、ROS爆發(fā)、線粒體細胞色素C的釋放、Bax/Bc1-2上升,Fas基因上調(diào)以及caspase3、8和9活性升高?？寡趸瘎㎞AC抑制GLA誘導的ROS產(chǎn)生后,HL-60細胞的存活率,線粒體膜電位上升,細胞凋亡率下降。
　　 結(jié)論:本文實