喜樹堿誘導(dǎo)甜菜夜蛾細(xì)胞凋亡的線粒體途徑及機(jī)理研究.pdf

1、線粒體在細(xì)胞凋亡中占據(jù)重要地位，但線粒體在昆蟲細(xì)胞凋亡中的作用還鮮有研究。我們課題組在研究喜樹堿(camptothecin，CPT)的作用機(jī)制的過程中發(fā)現(xiàn)其可能通過誘導(dǎo)昆蟲細(xì)胞凋亡而起到殺蟲作用，而此過程中涉及線粒體的參與。但線粒體是如何參與CPT誘導(dǎo)的昆蟲細(xì)胞凋亡過程以及線粒體與昆蟲細(xì)胞凋亡的關(guān)系還不得而知。為了進(jìn)一步闡明CPT與HCPT誘導(dǎo)的線粒體途徑以及CPT及羥基喜樹堿(10-hydroxycamptothecin，HCPT)的

2、毒理學(xué)機(jī)制，我們研究了CPT和HCPT對甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）中腸脂肪體細(xì)胞系IOZCAS-Spex-Ⅱ的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)、凋亡過程中線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能的改變及改變機(jī)制，得到如下研究結(jié)果:
　　通過PI/AnnexinⅤ-FITC雙染法檢測了CPT和HCPT誘導(dǎo)的IOZCAS-Spex-Ⅱ細(xì)胞凋亡隨藥劑處理時間和處理濃度的變化。發(fā)現(xiàn)CPT和HCPT均可顯著地誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，具有時間和濃度依賴效應(yīng)。CPT和H

3、CPT處理24 h，細(xì)胞凋亡率分別為53.57％和51.46％，MTT法檢測細(xì)胞活性抑制率分別為53.13％和54.85％，表明細(xì)胞凋亡率與細(xì)胞活性抑制率的變化基本一致，表明CPT和HCPT通過誘導(dǎo)甜菜夜蛾細(xì)胞凋亡而導(dǎo)致其增殖活性受到抑制。
　　通過透射電鏡觀察了線粒體的亞顯微結(jié)構(gòu)，線粒體在CPT和HCPT刺激2h后即出現(xiàn)腫脹變圓，嵴彎曲，24h后線粒體分裂大量增多，線粒體外膜破裂。同時伴隨著細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)凝集，吞噬小泡增多等

4、凋亡現(xiàn)象。激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體的分布，線粒體隨著藥劑處理時間的延長，線粒體去極化，分布狀態(tài)也由均勻分布向簇狀、彌散狀轉(zhuǎn)化。表明CPT和HCPT能夠引起昆蟲細(xì)胞線粒體形態(tài)、結(jié)構(gòu)和分布的改變。
　　通過流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位、氧化自由基(reactive oxygen species，ROS)、鈣(calcium，Ca2+)，等線粒體功能指標(biāo)。CPT和HCPT處理后，早期ROS產(chǎn)生增多，12h左右降至最低，以后又大量產(chǎn)生，證

5、明了ROS產(chǎn)生是個鏈?zhǔn)竭B鎖放大反應(yīng)。胞質(zhì)Ca2+濃度增大，6-12 h增加最為顯著。而線粒體膜電位則一直處于下降趨勢，且在藥劑處理12h開始急劇下降。在選擇濃度范圍內(nèi)，隨著處理濃度的增大，ROS產(chǎn)生逐漸增多，線粒體膜電位的喪失增加，胞質(zhì)Ca2+濃度逐漸增大。表明CPT和HCPT引起的昆蟲細(xì)胞線粒體功能改變具有時間和濃度效應(yīng)。同時12h是線粒體發(fā)揮功能的一個關(guān)鍵時間點(diǎn)，線粒體在接收凋亡刺激后，產(chǎn)生大量的ROS，胞質(zhì)Ca2+釋放，線粒體膜電

6、位降低，線粒體膜通透化，進(jìn)而刺激產(chǎn)生更多ROS，促進(jìn)凋亡發(fā)生。
　　通過加入線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeablity transition pore，mPTP)的抑制劑環(huán)孢菌素A(CyclosporineA，CsA)，研究線粒體內(nèi)膜通透化轉(zhuǎn)換在CPT和HCPT誘導(dǎo)昆蟲細(xì)胞凋亡中的作用。發(fā)現(xiàn)CsA抑制了CPT和HCPT誘導(dǎo)的昆蟲細(xì)胞誘導(dǎo)的凋亡過程中Cytc從線粒體到胞質(zhì)的釋放、ROS的產(chǎn)生、膜電勢的喪失

7、以及胞質(zhì)Ca2+的釋放，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。證實CPT和HCPT誘導(dǎo)的昆蟲細(xì)胞凋亡具有線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔依賴性，但這種依賴性具有時間性，隨著線粒體功能的改變，細(xì)胞凋亡一旦發(fā)生，將以不可逆的態(tài)勢繼續(xù)發(fā)生，表明不依賴于線粒體通透性孔開放的凋亡路徑亦同時存在。
　　通過免疫方法和分光光度法分析了CPT和HCPT誘導(dǎo)甜菜夜蛾細(xì)胞IOZCAS-Spex-Ⅱ過程中DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的氧化狀況。研究發(fā)現(xiàn)CPT和HCPT能夠引起甜菜夜蛾細(xì)胞DNA

8、損傷，細(xì)胞脂質(zhì)和蛋白質(zhì)發(fā)生一定程度的氧化損傷，與對照組相比，48h氧化損傷顯著。表明CPT和HCPT對昆蟲細(xì)胞產(chǎn)生氧化壓力，產(chǎn)生過多ROS，導(dǎo)致昆蟲細(xì)胞DNA、脂質(zhì)和蛋白都產(chǎn)生氧化損傷，細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　綜上所述，CPT和HCPT處理引起昆蟲細(xì)胞產(chǎn)生ROS，造成細(xì)胞DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)過氧化，從而對昆蟲細(xì)胞產(chǎn)生毒性。凋亡途徑為線粒體內(nèi)途徑，具有一定的線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放依賴性。本論文首次系統(tǒng)地闡明了喜樹堿誘導(dǎo)的昆蟲細(xì)胞凋亡的機(jī)