家蠶內(nèi)源性piRNA促進(jìn)家蠶piggyBac轉(zhuǎn)座子的穩(wěn)定性.pdf

1、轉(zhuǎn)座子作為生物體中能夠獨(dú)立移動(dòng)的特異DNA序列元件，是自然界中最豐富的基因種類(lèi)之一，轉(zhuǎn)座子的存在與活動(dòng)使基因組并不是一個(gè)靜止的組合，而是一個(gè)不斷改變自身構(gòu)造的動(dòng)態(tài)機(jī)體，在進(jìn)化、個(gè)體差異和生物多樣性的保持中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。然而，轉(zhuǎn)座子的過(guò)度活躍也會(huì)引起基因組的紊亂，從而導(dǎo)致過(guò)量突變和各類(lèi)疾病的發(fā)生，因此，機(jī)體進(jìn)化出了一種新的機(jī)制—piRNA來(lái)平衡基因組的動(dòng)態(tài)變化。研究轉(zhuǎn)座子與piRNA之間的動(dòng)態(tài)平衡機(jī)制，對(duì)解開(kāi)進(jìn)化的神秘面紗和遺傳變

2、異的分子基礎(chǔ)，具有重要的意義。家蠶的性別決定為ZW型，具有強(qiáng)雌決定作用的W染色體可以轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生大量的piRNA，是研究轉(zhuǎn)座子與piRNA相互作用的理想研究模型。本研究通過(guò)調(diào)查家蠶W和Z染色體上外源piggyBac轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座活性，結(jié)合多層面轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法，揭示了轉(zhuǎn)座子活性與piRNA表達(dá)量之間的關(guān)系，所獲得的的主要結(jié)果和結(jié)論如下:
　　1、Z染色體單拷貝轉(zhuǎn)基因品系的建立
　　在本實(shí)驗(yàn)室前期研究中，已經(jīng)獲得了兩個(gè)插入位點(diǎn)位于W染

3、色體的轉(zhuǎn)基因品系，分別命名為T(mén)G-W1和TG-W2。為了探究Z染色體上的轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定性是否受到其piRNA的影響，從100多個(gè)轉(zhuǎn)基因品系中，篩選獲得了1個(gè)插入位點(diǎn)在Z染色體上的轉(zhuǎn)基因品系，命名為T(mén)G-Z。將TG-Z轉(zhuǎn)基因家蠶（♀）與野生型家蠶(♂)雜交，F(xiàn)1代個(gè)體中雄性家蠶的復(fù)眼和神經(jīng)中均能觀察到綠色熒光，雌性家蠶沒(méi)有熒光。將獲得TG-Z品系與野生型經(jīng)過(guò)5代雜交，后代結(jié)果都是雄性有綠色熒光，雌性無(wú)熒光表達(dá)。為了確認(rèn)該品系中綠色熒光轉(zhuǎn)基因

4、載體的插入位點(diǎn)，對(duì)該家蠶個(gè)體進(jìn)行了反向PCR，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因載體的插入位點(diǎn)是位于1號(hào)染色體上11.5Mb處，遺傳連鎖位置為23.7cM。
　　2、piggyBac轉(zhuǎn)座子在Z和W染色體上的穩(wěn)定性
　　為了檢測(cè)piggyBac轉(zhuǎn)座子在轉(zhuǎn)基因家蠶中的再轉(zhuǎn)座活性，我們發(fā)明了利用性染色體連鎖和穩(wěn)定表達(dá)外源轉(zhuǎn)座酶的策略。由于W染色體只存在于雌蠶中，因此W連鎖的轉(zhuǎn)基因只在雌性個(gè)體中能檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因標(biāo)記;Z染色體在雌蠶中只有一條，因此子代的Z

5、連鎖的雌蠶與非轉(zhuǎn)基因雄蠶的子代個(gè)體中只有雄性個(gè)體中能檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因標(biāo)記。將TG-W1、TG-W2和TG-Z的雌性家蠶分別與在家蠶全身表達(dá)轉(zhuǎn)座酶的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因品系TG-R雄性家蠶雜交，得到的后代命名為T(mén)-W1\W2＼Z-R;將F1代中同時(shí)含有綠色和紅色熒光的個(gè)體與野生型家蠶雜交，根據(jù)后代的熒光表達(dá)數(shù)目，計(jì)算piggyBac的再轉(zhuǎn)座率。結(jié)果顯示，piggyBac在TG-W1品系中的再轉(zhuǎn)座效率為2.77％;在TG-W2中為5.68％;在TG-Z中

6、為16.73％。表明piggyBac在W染色體上的再轉(zhuǎn)座效率要顯著低于Z染色體。
　　3、不同轉(zhuǎn)基因品系中的差異表達(dá)基因分析
　　為了探究piggyBac轉(zhuǎn)座子在三個(gè)轉(zhuǎn)基因品系間的再轉(zhuǎn)座率差異大的分子機(jī)理，我們提取了不同個(gè)體的卵巢和大腦組織RNA，進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。提取的樣品濃度均在200ng\μL以上，將提取的組織RNA進(jìn)行安捷倫檢測(cè)，RNA的完整度(RNA Integrity Number)均在6.0以上。對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)

7、據(jù)進(jìn)行基因差異表達(dá)分析(DEGs)、GO功能顯著性富集分析、Pathway顯著性富集分析三方面的數(shù)據(jù)分析，不同的轉(zhuǎn)基因個(gè)體間基因差異表達(dá)比較大，GO注釋分成了三類(lèi):基因的分子功能(molecular function)、細(xì)胞成分(cellular component)、參與的生物過(guò)程(biologicalprocess)，在不同的功能層面均有不同的基因注釋。Pathway主要將差異基因富集到細(xì)胞過(guò)程、環(huán)境信息加工、遺傳信息加工、新陳代謝

8、以及生物體系統(tǒng)通路。雖然我們鑒定到了較多的差異表達(dá)基因，但是對(duì)這些基因的深入分析并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其與轉(zhuǎn)座子活性有直接的關(guān)系，我們推測(cè)這些差異可能是由于不同轉(zhuǎn)基因的插入位點(diǎn)不一樣而引起的變化。
　　4、不同轉(zhuǎn)基因品系small RNA的鑒定與分析
　　從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析結(jié)果，推測(cè)piggyBac在不同染色體轉(zhuǎn)座效率的不同不是由特定基因的表達(dá)差異引起的，加之越來(lái)越多的線索表明轉(zhuǎn)座子的活性可能與piRNA的表達(dá)有較大的關(guān)系，因此，對(duì)不同

9、轉(zhuǎn)基因品系的卵巢和腦組織進(jìn)行了小RNA測(cè)序和分析。對(duì)miRNA也是做了與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)同樣的三個(gè)方面的分析，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著的差異，暗示miRNA與轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座活性也沒(méi)有直接的相關(guān)性;通過(guò)借助文獻(xiàn)中對(duì)piRNA分析的方法，發(fā)現(xiàn)大腦中的差異轉(zhuǎn)座子表達(dá)量明顯低于卵巢轉(zhuǎn)座子差異表達(dá)，而且卵巢中的piRNA表達(dá)量大約有76％，大腦中的piRNA表達(dá)量大約有24％。將piRNA與轉(zhuǎn)基因載體及其插入位點(diǎn)上下游序列比對(duì)，結(jié)果表明TG-W1\W2\Z卵巢比對(duì)上

10、的piRNA數(shù)量大于大腦中比對(duì)上的數(shù)量，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)卵巢中轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)的兩側(cè)具有高量的piRNA富集，其中TG-Z插入位點(diǎn)附近中piRNA的數(shù)量顯著低于TG-W1\W2中piRNA的數(shù)量。這一結(jié)果暗示，piggyBac轉(zhuǎn)座子在W和Z染色體上再轉(zhuǎn)座效率的差異可能是由于插入位點(diǎn)附近piRNA含量的差異導(dǎo)致的。
　　綜上所述，本論文通過(guò)轉(zhuǎn)基因、遺傳學(xué)分析、轉(zhuǎn)錄組分析和小RNA測(cè)序，首次揭示了piggyBac這一廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)