基于piggyBac轉(zhuǎn)座子的家蠶定向遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)已在生物基因功能分析、生理生化過(guò)程研究以及生物反應(yīng)器開(kāi)發(fā)等方面大量應(yīng)用,但同時(shí)還存在許多問(wèn)題,包括外源基因向基因組的整合效率較低,轉(zhuǎn)基因有時(shí)不能按預(yù)定的方式表達(dá),轉(zhuǎn)入基因后有可能引起生物本身的功能基因發(fā)生突變等。要解決這些問(wèn)題,提高遺傳轉(zhuǎn)化的效率,并提高整合的定向性(Site-specific integration)是關(guān)鍵。
　　 家蠶Bombyx mori L.是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng),同時(shí)也是昆蟲(chóng)基因功能和生命過(guò)程研究

2、的模式昆蟲(chóng)。近十多年來(lái),人們對(duì)其開(kāi)展了大量的遺傳轉(zhuǎn)化研究,獲得了很多的家蠶轉(zhuǎn)基因品系,但對(duì)其定向遺傳轉(zhuǎn)化的報(bào)道還很少。為此,本實(shí)驗(yàn)在家蠶細(xì)胞中進(jìn)行了定向遺傳轉(zhuǎn)化的初步研究,以期為提高家蠶遺傳轉(zhuǎn)化效率、提高遺傳轉(zhuǎn)化的定向性提供一些借鑒。主要結(jié)果如下:
　　 1.采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)(Dual-Luciferase Reporter Assay)技術(shù),比較了熱激蛋白啟動(dòng)子(hsp70和hsp82)、家蠶肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(.A3)

3、、多聚泛素(polyubiquitin)啟動(dòng)子(PuB)、α微管蛋白啟動(dòng)子(α-tub)、絲素輕鏈啟動(dòng)子(Fib-L)、人工合成啟動(dòng)子3xP3及苜蓿丫紋夜蛾多角體病毒(AcNPV)增強(qiáng)子-啟動(dòng)子組合(hr5-IE1)8種啟動(dòng)子在家蠶細(xì)胞BmN內(nèi)的活性。結(jié)果顯示hr5-IE1活性最強(qiáng),A3次之,其余啟動(dòng)子活性均較弱。構(gòu)建含有hr5-IE1啟動(dòng)子和piggyBac的轉(zhuǎn)座酶編碼區(qū)的質(zhì)粒作為輔助質(zhì)粒,與EGFP載體質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞后,實(shí)現(xiàn)了

4、EGFP基因整合到細(xì)胞基因組中。
　　 2.采用質(zhì)粒間轉(zhuǎn)座分析(Interplasmid transposition assay)方法,研究了酵母轉(zhuǎn)錄激活蛋白Gal4的DNA結(jié)合區(qū)(DNA-binding domain,DBD)序列和UAS組成的系統(tǒng)(簡(jiǎn)稱Gal4-JAS系統(tǒng))在提高家蠶遺傳轉(zhuǎn)化定向性中的作用。將三個(gè)質(zhì)粒,即表達(dá)Gal4-piggyBac融合轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒,含有Kan抗性基因和E.coli ori因子的供體質(zhì)粒

5、,及含有UAS定向序列的受體質(zhì)粒,共轉(zhuǎn)染家蠶卵巢細(xì)胞系(Bm2-12)和果蠅細(xì)胞系(S2),結(jié)果發(fā)現(xiàn),在Gal4-piggyBac融合體作用下,兩種細(xì)胞中的轉(zhuǎn)座效率分別比對(duì)照提高了3.8倍和4.5倍,而且插入位置趨向于少數(shù)幾個(gè)位點(diǎn)。3.LexA是生物體內(nèi)一種重要的阻遏蛋白,其結(jié)合的DNA位點(diǎn)(Binding sites,BS)具明顯的序列特征。我們依據(jù)LexA與其BS序列結(jié)合的原理,構(gòu)建了可表達(dá)LexA-piggyBac融合轉(zhuǎn)座酶的輔助

6、質(zhì)粒,以及含LexA BS序列的受體質(zhì)粒pGDV1-Lex-BS。將這兩個(gè)質(zhì)粒和供體質(zhì)粒pB[Koα]一起轉(zhuǎn)染家蠶Bm-12細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照相比轉(zhuǎn)化效率提高了9.0倍,但轉(zhuǎn)座并不集中在一些特定的位點(diǎn)。與前述Gal4-piggyBac融合轉(zhuǎn)座酶相比,在Bm-12細(xì)胞系中,LexA-piggyBac介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化效率要高一些,但對(duì)轉(zhuǎn)化的定向能力較差。
　　 4.在家蠶細(xì)胞內(nèi)建立了一個(gè)基因組中插入EGFP-Lex-BS片段的細(xì)胞

7、系。用于今后LexA-piggyBac融合轉(zhuǎn)座酶在提高轉(zhuǎn)座效率、定向能力等方面的進(jìn)一步研究。
　　 根據(jù)本研究結(jié)果,針對(duì)目前家蠶遺傳轉(zhuǎn)化效率較低、轉(zhuǎn)基因的整合缺乏定向性的不足,可選擇采用hr5-IE1作為piggy,Bac轉(zhuǎn)座酶表達(dá)的啟動(dòng)子,以提高該酶的表達(dá)水平,從而提高轉(zhuǎn)化效率;也可采用piggyBac和Gal4-DBD或LexA融合后所形成的轉(zhuǎn)座酶來(lái)提高轉(zhuǎn)化效率;另外,Gal4-piggyBac融合酶還可考慮用于定向遺傳轉(zhuǎn)化