黃連素誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞凋亡時活性氧與谷胱甘肽的變化及機制探討.pdf

1、細(xì)胞內(nèi)、外源性活性氧不僅可以廣泛地參與調(diào)節(jié)細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑,而且還可以通過修飾蛋白質(zhì)或改變細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài),參與調(diào)控細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
　　本文檢測了黃連素單獨處理及經(jīng) NAC保護后 HepG-2細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞內(nèi)活性氧與谷胱甘肽的變化,探討了黃連素誘導(dǎo) HepG-2細(xì)胞凋亡的機制。
　　利用 SRB法檢測細(xì)胞增殖率;倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài);熒光染料Hoechst33258觀察細(xì)胞核形態(tài);流式細(xì)胞術(shù)(PI

2、單染法,Annexin-V-PI雙染法)檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡;DCFH-DA染色后流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧并觀察細(xì)胞內(nèi)活性氧分布;比色法檢測細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽。結(jié)果如下:
　　(1) SRB法檢測細(xì)胞毒性結(jié)果顯示,黃連素對人肝癌細(xì)胞HepG-2有較強的毒性,作用存在時間-劑量依賴效應(yīng)。濃度10μmol·L-1到80μmol·L-1時,表現(xiàn)為增殖抑制作用,隨藥物時間的延長其增殖抑制作用增強;其半抑制濃度IC50值24h時為44.10

3、 mol·L-1,48h為8.53μmol·L-1。當(dāng)藥物濃度增加到160μmol·L-1以上時,細(xì)胞開始死亡,表現(xiàn)為致死效應(yīng)。
　　(2)使用倒置顯微鏡和 Hoechst33258染色后熒光顯微鏡對細(xì)胞形態(tài)和核染色結(jié)果顯示,黃連素引起 HepG-2細(xì)胞胞體收縮,細(xì)胞變圓、失去貼壁能力,細(xì)胞核出現(xiàn)染色質(zhì)凝集、邊緣化與核碎裂,表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡的形態(tài)特征。但抗氧化劑NAC保護后,凋亡特征有一定的緩解。
　　(3) AO/EB熒光雙

4、染觀察結(jié)果顯示,黃連素誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞發(fā)生凋亡。抗氧化劑 NAC保護后,凋亡細(xì)胞數(shù)量有所降低。細(xì)胞增殖率實驗顯示,與 NAC聯(lián)合作用后,黃連素作用于HepG-2的增殖率回升,NAC保護效果明顯。
　　(4) PI染色經(jīng)流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期結(jié)果顯示,45和160μmol·L-1黃連素處理HepG-2細(xì)胞24h后出現(xiàn)“亞G1峰”(Sub-G1期),Sub-G1期細(xì)胞的比率與藥物濃度和處理時間呈正相關(guān),并出現(xiàn)HepG-2細(xì)胞S期周

5、期阻滯。黃連素與NAC聯(lián)合作用降低了HepG-2 Sub-G1期細(xì)胞百分比,從45μmol·L-1黃連素處理的15.53％減少到10.93%,160μmol·L-1黃連素處理的20.13%減少到14.73%。Annexin-V-PI復(fù)染流式分析法結(jié)果顯示,45μmol·L-1黃連素引起HepG-2細(xì)胞凋亡,160μmol·L-1處理的細(xì)胞主要表現(xiàn)為由早期凋亡逐步向晚期凋亡發(fā)展的進(jìn)程。經(jīng)NAC保護后, HepG-2細(xì)胞凋亡率有所降低。

6、r>　　(5) DCFH-DA染色流式細(xì)胞術(shù)檢測以及熒光顯微鏡觀察胞內(nèi)ROS表明,45和160μmol·L-1黃連素處理 HepG-2細(xì)胞6h、12h、24h,胞內(nèi) ROS含量持續(xù)升高,與黃連素的作用存在時間-劑量效應(yīng)。NAC的加入可以降低黃連素產(chǎn)生的ROS量。比色法檢測 GSH表明,作用6h、12h、24h時,45和160μmol·L-1使胞內(nèi) GSH含量持續(xù)降低,與黃連素的作用存在時間和劑量依賴負(fù)效應(yīng)。并且NAC可以使黃連素降低的G