環(huán)形病毒AGV2的檢測(cè)及其VP1-3基因表達(dá).pdf

1、雞傳染性貧血病毒(CAV)是圓環(huán)病毒科環(huán)形病毒屬中最早被鑒定，也是目前該屬中唯一經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)分離到的成員。自2011年，CAV相關(guān)的環(huán)形病毒序列AGV2，不僅在雞體中被鑒定，而且在人的皮膚棉試、血液以及糞便樣品中被檢測(cè)到。提示，研究AGV2具有潛在的公共衛(wèi)生意義。那么，AGV2是否與CAV一樣，對(duì)雛雞具有致病性，能誘導(dǎo)免疫抑制？AGV2在國(guó)內(nèi)雞群的分子流行情況又是如何？這些問(wèn)題均有待進(jìn)一步闡明。為探究國(guó)內(nèi)雞群及人群中是否存在AGV2，建立

2、檢測(cè)AGV2血清學(xué)診斷方法，本研究對(duì)揚(yáng)州部分活禽市場(chǎng)雞群及人群血清樣本進(jìn)行了AGV2檢測(cè)，并對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行了AGV2的VP1、VP2、VP3基因克隆，原核、真核表達(dá)及多抗的制備。本研究的開(kāi)展，首次明確了國(guó)內(nèi)活禽市場(chǎng)雞群及人群存在AGV2。AGV2的VP1、VP2、VP3的原核及真核表達(dá)載體及產(chǎn)物的獲得，具有良好反應(yīng)性的抗VP2和VP3的小鼠多克隆抗體制備，為建立AGV2血清學(xué)檢測(cè)方法以及探究AGV2的VP2和VP3蛋白分子生物學(xué)特性打下

3、了基礎(chǔ)。
　　1.國(guó)內(nèi)活禽市場(chǎng)及人群AGV2的檢測(cè)
　　為明確國(guó)內(nèi)雞群及人群中是否存在AGV2，首先建立了檢測(cè)AGV2的PCR方法。以TA克隆陽(yáng)性質(zhì)粒為模版進(jìn)行的靈敏度檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該P(yáng)CR擴(kuò)增AGV2的靈敏度可達(dá)2.7個(gè)拷貝數(shù)。對(duì)4個(gè)不同的活禽市場(chǎng)共54份雞群羽囊組織樣品以及人的178份血樣樣品的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)12個(gè)AGV2陽(yáng)性樣品，其中10個(gè)來(lái)自活禽市場(chǎng)雞群，另2個(gè)來(lái)自人血清樣品。4個(gè)不同活禽市場(chǎng)雞群AGV2的陽(yáng)性率分別為25％，

4、12.5％，15.8％以及20％;人血清樣品AGV2的陽(yáng)性率為1.1％。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，本研究檢測(cè)到的12個(gè)AGV2序列間的同源性為98.3％-100％，而與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道的AGV2序列的同源性在92.2％-99.1％。值得注意的是，這12個(gè)AGV2序列與NCBI中AGV2原型株Ave3以及國(guó)內(nèi)人源株China的相應(yīng)序列的同源性分別僅為92.2％-93％以及93％-93.9％，而與檢測(cè)于人及雪貂的CL33，G13和915F0

5、6007相應(yīng)序列的同源性達(dá)99.1％。進(jìn)化樹(shù)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)檢測(cè)到AGV2可以分為兩個(gè)分支。另外，在一腫瘤發(fā)病雞群的診斷與檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，AGV2與CAV以及MDV存在共感染。這些研究結(jié)果表明，國(guó)內(nèi)活性市場(chǎng)雞群確實(shí)存在環(huán)形病毒AGV2，并被發(fā)現(xiàn)于人血清樣品中。然AGV2的分子流行，致病性，與CAV、MDV混合感染對(duì)CAV以及MDV致病性的影響等尚待進(jìn)一步研究。
　　2.AGV2的VP1、VP2、VP3蛋白原核表達(dá)及多抗制備

6、　　為獲得建立AGV2血清學(xué)診斷用抗原，對(duì)AGV2的VP1、VP2、VP3蛋白進(jìn)行了原核表達(dá)。利用商品化的重組酶ExnaseTMⅡ不經(jīng)酶切，直接將VP1、VP2、VP3基因或片段的PCR產(chǎn)物分別與線性化的pGEX-6p-1載體進(jìn)行快速重組構(gòu)建了GST-VP11-462，GST-VP1_463-924，GST-VP1_925-1383，GST-VP1_735-1089，GST-VP2_1-348，GST-VP2_348-750以及GST-

7、VP3等7個(gè)GST融合表達(dá)質(zhì)粒。相應(yīng)陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化BL21后，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE以及Western blot分析結(jié)果表明，GST-VP1_463-924，GST-VP1_735-1089，GST-VP2_1-348以及GST-VP3的表達(dá)產(chǎn)物具有可溶性，而其它蛋白主要以包涵體形式存在。可溶性GST-VP2_1-348以及GST-VP3蛋白經(jīng)GST柱純化后，GST-VP2_1-348以及GST-VP3蛋白濃度分別為1.

8、6mg/ml及1.0mg/ml。純化的GST-VP2_1-348以及GST-VP3蛋白經(jīng)免疫小鼠，分別獲得了ELISA效價(jià)達(dá)1萬(wàn)的抗GST-VP2以及GST-VP3的小鼠多克隆抗體。這些AGV2的VP1、VP2、VP3原核表達(dá)載體的構(gòu)建，表達(dá)產(chǎn)物及多抗的獲得為進(jìn)一步建立AGV2血清學(xué)診斷方法提供了原核表達(dá)抗原，為研究AGV2生物學(xué)特性提供了試劑。
　　3.AGV2的VP2，VP3蛋白真核表達(dá)及其特性
　　為進(jìn)一步探究AGV2

9、的VP2及VP3生物學(xué)功能，對(duì)AGV2的VP2及VP3基因進(jìn)行了真核表達(dá)。利用商品化的重組酶ExnaseTMⅡ不經(jīng)酶切，直接將VP2以及VP3基因PCR產(chǎn)物分別與線性化的pcDNA3.1(＋)載體進(jìn)行重組連接構(gòu)建了pcDNA3.1-VP2以及pcDNA3.1-VP3真核表達(dá)質(zhì)粒。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞36小時(shí)后，進(jìn)行Western blot分析。、以抗GST-VP3以及GST-VP2_1-348的小鼠多克隆抗體為一抗進(jìn)行的Wester

10、n blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-VP2以及pcDNA3.1-VP3質(zhì)粒的293T細(xì)胞中分別出現(xiàn)分子量大小為34kDa，14KDa的蛋白特異性條帶。同時(shí)構(gòu)建了EGFP-VP3融合表達(dá)載體。EGFP-VP3轉(zhuǎn)染HCT116結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，EGFP-VP3定位于細(xì)胞核內(nèi)，且呈散在的點(diǎn)狀分布，類似凋亡小體。這些AGV2的VP2以及VP3真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)不僅為建立AGV2血清學(xué)診斷方法提供了真核表達(dá)抗原，而且為進(jìn)一步