柯薩奇病毒B3腺病毒載體疫苗rAd-VP1和rAd-VP22-L-VP1的構(gòu)建及表達.pdf

1、目的：柯薩奇病毒B組3型(Coxsackievirus group B type3,CVB3)感染所致的病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)嚴(yán)重危害人類健康，也是新生兒猝死的重要原因，目前尚無有效的預(yù)防方法。VP1是CVB3的主要中和抗原，能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫。以質(zhì)粒為載體構(gòu)建的CVB3 VP1基因疫苗免疫小鼠后，雖可誘導(dǎo)產(chǎn)生低效價的中和抗體，但不能有效阻止致死量病毒感染。因此，提高免疫原性、增強免疫效果是

2、CVB3 VP1疫苗亟需解決的問題。 目前提高免疫效果的關(guān)鍵因素之一是開發(fā)具有較高基因轉(zhuǎn)移率和靶向特異性的轉(zhuǎn)基因載體。在眾多載體體系中，復(fù)制缺陷型腺病毒載體系統(tǒng)（Replication-DefectiveAdenovirus Vector System)以其廣泛的宿主范圍、極高的轉(zhuǎn)染效率以及外源基因高表達等特點，在疫苗載體選擇中表現(xiàn)出優(yōu)勢，成為極具應(yīng)用前景的基因轉(zhuǎn)移載體。 盡管腺病毒載體有較高的轉(zhuǎn)染人體細(xì)胞的能力，但表達

3、的蛋白如不能很快地穿梭和擴散到更多的免疫活性細(xì)胞，仍不能有效提高抗原提呈效率。因此基因預(yù)防的又一關(guān)鍵是使受染細(xì)胞表達的抗原蛋白能有效地擴散到免疫活性細(xì)胞。VP22是I型單純皰疹病毒UL49基因編碼的長301個氨基酸的堿性蛋白質(zhì)，具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(protein transductiondomain，PTD)，能夠把與之融合的蛋白或與之結(jié)合的DNA等大分子跨膜送遞到鄰近細(xì)胞。利用這一特性，將與VP22融合的抗原送遞到周圍的免疫活性細(xì)胞，

4、提高其抗原的提呈效率，可望顯著增強疫苗的免疫原性。本研究以CVB3為對象，利用.AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建、包裝重組腺病毒rAd/VP22-L-VP1和rAd/VP1，并觀察它們在293細(xì)胞中的表達，為構(gòu)建用于人類的CVB3疫苗奠定基礎(chǔ)。 方法： 1. 目的基因的擴增與鑒定 以編碼VP22蛋白的質(zhì)粒pAP85H為模板，擴增VP22-Linker基因。以編碼VP1蛋白的質(zhì)粒pcDNA3/VP1為模板，擴增VP1

5、和Linker-VP1基因。將上述3種擴增產(chǎn)物分別與pGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，構(gòu)建質(zhì)粒pGEM-T/VP22-L、pGEM-T/VPl和pGEM-T/L-VP1。提取質(zhì)粒進行酶切鑒定和測序，篩選重組子。 2. 重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建 將上述3種質(zhì)粒以合適的限制性內(nèi)切酶進行雙酶切，回收帶粘末端的 3 種目的片段，將VP1、VP22-Linker和Linker-VP1分別與經(jīng)相應(yīng)限制性內(nèi)切酶雙酶切的腺病毒穿梭載

6、體pAdTrack-CMV連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選和酶切鑒定，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒AdTrack-CMV/VP1和AdTrack-CMV/VP22-L-VP1。 3. 重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建 將 pAdTrack-CMV、AdTrack-CMV/VP1和AdTrack-CMV/VP22-L-VP1 3種質(zhì)粒分別用內(nèi)切酶Pme I線性化。利用AdEasy系統(tǒng)，經(jīng)兩步法分別在大腸桿菌Bj5183中與骨架載體pAdEasy-1同源重組，構(gòu)

7、建重組腺病毒質(zhì)粒pAd、pAd/VP1和pAd/VP22-L-VP1。經(jīng)Pac I酶切，PCR鑒定后，將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)E.coliDH5α，挑取陽性克隆。以堿裂解法大量提取 3 種重組質(zhì)粒，并用聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)沉淀法進行純化。 4. 重組腺病毒的包裝與擴增 以上重組腺病毒質(zhì)粒分別用內(nèi)切酶 Pac Ⅰ線性化，以陽離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK293(human embryo kidn

8、ey 293 derived cell line)細(xì)胞，并觀察報告基因綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表達。凍融法收集初代病毒液。取初代病毒液感染293細(xì)胞，逐日觀察細(xì)胞病變(cytopathic effect,CPE)，及有無彗星樣斑塊(FOCI)形成。并經(jīng)三至四輪傳代擴增，提高病毒滴度。 5. 病毒感染后48小時，提取細(xì)胞總蛋白，通過Western Blot檢測病毒蛋白的表達。

9、 6. 重組腺病毒滴度測定 待293細(xì)胞在96孔板中生長至70-80％匯合時，以系列稀釋的上述各代病毒液感染細(xì)胞，感染后48小時GFP陽性細(xì)胞計數(shù)法測定病毒滴度。病毒滴度：熒光細(xì)胞數(shù)×病毒液的稀釋倍數(shù)/病毒液量(pfu/ml) 結(jié)果： 1. 成功構(gòu)建pGEM-T/VP22-L、pGEM-T/VP1和pGEM-T/L-VP1，采用DNA測序和雙酶切，證實這3段基因片段均與報道的基因序列一致。 2. 成功

10、構(gòu)建穿梭質(zhì)粒 AdTrack-CMV/VP1 和AdTrack-CMV/VP22-L-VP1，限制酶切分析證明均與預(yù)期相符。 3. 成功構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒 pAd、pAd/VP1 和pAd/VP22-L-VP1，用 Pac Ⅰ酶切得到約 30kb 的片段和一個3.0kb或4.5kb的小片段，PCR鑒定目的基因長度均與預(yù)期值相符。 4. 轉(zhuǎn)染48小時后，熒光顯微鏡下可觀察到293細(xì)胞有報告基因GFP的表達，表明重組腺病毒r

11、Ad、rAd/VP1和rAd/VP22-L-VP1包裝成功。初代病毒液再次感染293細(xì)胞，在熒光顯微鏡下可逐日觀察到細(xì)胞病變和熒光聚集，各代病毒液感染細(xì)胞后均有特征性彗星樣熒光斑塊形成。 5. 重組腺病毒重新感染293細(xì)胞48小時后，提取細(xì)胞蛋白，經(jīng)Western Blot檢測，VP1、VP22-L-VP1蛋白均有表達。 6. 感染48小時后在熒光顯微鏡下觀察，各組病毒滴度為：rAd初代至第四代病毒滴度分別為1.2×10

12、5 pfu/ml、4.07×106 pfu/ml、1.47×107 pfu/ml 和 9.6×107 pfu/ml。rAd/VP1 初代至第四代病毒滴度分別為 2.67×105 pfu/ml、1.82×100 pfu/ml、3.67×100 pfu/ml 和 1.6×107 pfu/ml。rAd/VP22-L-VP1 初代至第四代病毒滴度分別為2.53×105pfu/ml、1.53×100 pfu/ml、1.40×107 pfu/ml

13、和 6.77×107pfu/ml。 結(jié)論： 1. 成功構(gòu)建并包裝重組腺病毒rAd、rAd/VP1 和rAd/VP22-L-VP1，體外感染293細(xì)胞可見VP1及VP22和VP1 融合蛋白的表達。 2. 經(jīng)第三、第四輪擴增，每升高一代可使病毒滴度增加約10倍。 3. 本研究利用 AdEasy 腺病毒載體系統(tǒng)成功包裝了重組腺病毒載體疫苗 rAd/VP22-L-VP1 和 rAd/VP1，為發(fā)展新型的CVB3載