家貓血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2基因表達(dá)、突變體構(gòu)建及作為SARS-CoV受體的功能研究.pdf

1、2002年冬天至2003年，我國(guó)爆發(fā)嚴(yán)重急性呼吸綜合癥，并迅速傳播至全球二十多個(gè)國(guó)家，導(dǎo)致8000多人感染，將近10％感染者死亡，一種新的冠狀病毒（SARS-CoV）是這場(chǎng)疫情的元兇。SARS-CoV的傳播與動(dòng)物有關(guān)。2003年，研究人員從果子貍中分離到了SARS病毒，全基因組序列與人類(lèi)SARS病毒具有99％的同源性。最近研究又發(fā)現(xiàn)蝙蝠攜帶有類(lèi)SAR-CoV，與人SARS-CoV基因組序列同源性達(dá)92％，不過(guò)這種病毒不會(huì)直接感染人類(lèi)。野

2、生蝙蝠可能是非典病毒的源頭宿主，果子貍只不過(guò)是SARS-CoV變異傳播鏈上一個(gè)很重要的環(huán)節(jié)，作為SARS-CoV的中間宿主和重要載體將病毒從野外傳染到人類(lèi)身上。家貓也是SARS-CoV的易感動(dòng)物。2003年SARS大爆發(fā)期間，在香港陶大花園SARS患者家中的寵物貓血清中檢測(cè)到了SARS-CoV。SARS-CoV人工感染家貓、雪貂也獲得成功，病毒能夠在家貓?bào)w內(nèi)正常增殖，被感染的家貓能有規(guī)律排毒，出現(xiàn)與人類(lèi)SARS-CoV感染類(lèi)似的病理變化

3、，并可將病毒傳染給與其共同飼養(yǎng)的原本不帶毒的動(dòng)物。 人的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）是SARS-CoV的一個(gè)功能性受體，本實(shí)驗(yàn)室首次克隆了家貓ACE2基因，為了深入探討家貓ACE2基因作為SARS-CoV受體及其在SARS傳播中的作用，本研究開(kāi)展了如下工作： （1）家貓ACE2空間結(jié)構(gòu)建模：家貓ACE2基因編碼的氨基酸序列與人ACE2同源性達(dá)85％，本研究以人ACE2結(jié)構(gòu)為模板，用同源模建法建立了貓ACE2的三維空間結(jié)

4、構(gòu)模型，蛋白質(zhì)對(duì)接法模擬了貓ACE2分子與SARS-CoV S的RBD結(jié)合。所預(yù)測(cè)的三維結(jié)構(gòu)基本在一定程度上能反映出貓ACE2真實(shí)的空間構(gòu)象，預(yù)測(cè)得到的模型與人ACE2的空間結(jié)構(gòu)非常相似。比較ACE2分子中與SARS-CoV S蛋白受體結(jié)合區(qū)相接觸的18個(gè)氨基酸，家貓ACE2只有三個(gè)氨基酸與人ACE2不同，分別為L(zhǎng)24Q、E38D與T82M，提示家貓ACE2可能為SARS-CoY的功能性受體。 （2）家貓ACE2原核表達(dá)及與SA

5、RS-CoV S1蛋白的結(jié)合：人ACE2的受體功能區(qū)位于N端，SARS-CoV的受體結(jié)合蛋白為其纖突蛋白S1蛋白。為了獲得家貓ACE2作為SARS-CoV受體的直接證據(jù)，本研究在大腸桿菌BL21（DE3）中表達(dá)了家貓ACE2 N端19aa-367aa，并純化得到重組蛋白。經(jīng)配體轉(zhuǎn)印試驗(yàn)和ELISA均證實(shí)，重組的fACE2<,19～367>蛋白片段能夠與重組的SARS-CoV S1蛋白結(jié)合。 （3）貓ACE2基因的真核表達(dá)：為了深

6、入研究貓ACE2基因的受體活性，進(jìn)一步構(gòu)建了基因片段的真核表達(dá)載體pcDNA-mfA367，間接免疫熒光檢測(cè)表明家貓ACE2 N端1aa-367aa在細(xì)胞膜上實(shí)現(xiàn)了定位表達(dá)。這為深入研究貓ACE2的SARS-CoV受體功能提供了重要工具。 （4）家貓ACE2突變體構(gòu)建：為了進(jìn)一步研究家貓ACE2在SARS～CoV跨種感染中的地位，本研究進(jìn)行了家貓ACE2系列突變體構(gòu)建。針對(duì)已報(bào)道的人ACE2決定SARS-CoV受體功能的關(guān)鍵氨基

7、酸，以pcDNA-mfA367為模板，用定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建了六個(gè)單位點(diǎn)突變體。在此基礎(chǔ)上，對(duì)突變體進(jìn)行了真核表達(dá)，進(jìn)一步用假病毒感染試驗(yàn)、合胞體觀察實(shí)驗(yàn)、免疫熒光等檢測(cè)了貓ACE2及其突變體與SARS-CoV之間的相互作用。 總之，本研究獲得貓ACE2作為SARS～CoV受體的生物信息學(xué)證據(jù)及直接的體外實(shí)驗(yàn)證據(jù)。構(gòu)建了貓ACE2的原核與真核表達(dá)載體，獲得系列ACE2的系列突變體并進(jìn)行了真核表達(dá)與功能分析。為進(jìn)一步研究家貓ACE2在