人sBLyS突變體的構(gòu)建及功能研究.pdf

1、B淋巴細(xì)胞刺激因子(Blymphocytestimulator，BLyS)，是腫瘤壞死因子(TNF)超家族的成員。人BLyS全長(zhǎng)285個(gè)氨基酸，為Ⅱ型跨膜蛋白，有膜結(jié)合型和可溶性兩種形式，其發(fā)揮功能的主要區(qū)域?yàn)?34-285位氨基酸殘基(sBLyS)，其受體TACI、BCMA和BAFF-R主要表達(dá)于B淋巴細(xì)胞。作為B淋巴細(xì)胞的共刺激因子，BLyS通過(guò)與B淋巴細(xì)胞表面受體結(jié)合而誘導(dǎo)其增殖、分化和免疫球蛋白產(chǎn)生，在體液免疫中發(fā)揮著重要作用。

2、研究表明，BLyS表達(dá)缺陷將導(dǎo)致過(guò)渡B細(xì)胞缺失，外周B細(xì)胞顯著減少，無(wú)法產(chǎn)生正常的體液免疫反應(yīng)；其過(guò)表達(dá)將導(dǎo)致B細(xì)胞嚴(yán)重增多，是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosus，SLE)、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis，RA)、干燥綜合征(Sj(o)gren'ssyndrom，SS)等自身免疫性疾病的病因之一，其血清濃度往往與病情的嚴(yán)重程度存在一定的正相關(guān)。因此，一方面可通過(guò)增強(qiáng)BLyS的活性來(lái)

3、增強(qiáng)其刺激B細(xì)胞增殖及免疫球蛋白的產(chǎn)生，可能對(duì)治療免疫缺陷疾病發(fā)揮作用；另一方面可設(shè)法抑制BLyS的功能，以此作為治療自身免疫性疾病的候選策略。 為此我們克隆了人sBLyScDNA的突變體(s△BLyS、sBLyS-G、sBLyS-S)，并對(duì)其進(jìn)行原核表達(dá)、純化及功能研究，同時(shí)還構(gòu)建了sBLyS及其突變體的酵母表達(dá)載體，為探討sBLyS的作用機(jī)制及其與相關(guān)疾病的關(guān)系創(chuàng)造條件。并取得了如下結(jié)果： 1.以pUC19/sBLy

4、S為模板，經(jīng)一步反向PCR致突變法成功擴(kuò)增了缺失編碼第142～160氨基酸殘基的cDNA序列、以編碼甘氨酸的GGG替換第146位半胱氨酸TGC的cDNA序列、以編碼絲氨酸的TCC替換第146位半胱氨酸TGC的cDNA序列，分別命名為pUC19/s△BLyS、pUC19/sBLyS-G和pUC19/sBLyS-S。經(jīng)測(cè)序后與GenBank比對(duì)，與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的序列完全一致。 2.將上述測(cè)序正確的目的片段分別連接于原核表達(dá)載體pQE-8

5、0L，成功地構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pQE-80L/s△BLyS、pQE-80L/sBLyS-G和pQE-80L/sBLyS-S。 3.將上述質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，均獲得了較高水平的表達(dá)，并確立了這些突變體在大腸桿菌中高效表達(dá)的優(yōu)化條件為：pQE-80L/s△BLyS終濃度為0.5mmol/L、pQE-80/sBLyS-G和pQE-80L/sBLyS-S終濃度為1mmol/L的IPTG在37℃誘導(dǎo)表達(dá)4h。

6、SDS-PAGE分析可見(jiàn)，各重組蛋白的相對(duì)分子量大小依次約為18×103、20×103和20×103，主要以包涵體的形式表達(dá)。Westernblotting分析顯示，各目的蛋白均在相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)分子量處呈現(xiàn)單一條帶。 4.經(jīng)Ni2+-NTA系統(tǒng)純化及尿素透析，各重組蛋白得到了有效純化和復(fù)性。純化蛋白在SDS-PAGE上呈現(xiàn)單一條帶。復(fù)性蛋白經(jīng)SephadexG75柱層析顯示，以單體和三聚體兩種形式存在。 5.功能研究結(jié)果表明，

7、本實(shí)驗(yàn)所制備的重組蛋白s△BLyS能抑制人外周血淋巴細(xì)胞和Raji細(xì)胞的增殖；制備的重組蛋白sBLyS-G、sBLyS-S不僅可刺激人外周血淋巴細(xì)胞和Raji細(xì)胞的增殖，而且能抑制腫瘤細(xì)胞U937的生長(zhǎng)。其中sBLyS-S的促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖功能和對(duì)腫瘤細(xì)胞U937的殺傷功能比野生型sBLyS更強(qiáng)。 6.以pUC19/sBLyS及其突變體(pUC19/s△BLyS、pUC19/sBLyS-G和pUC19/sBLyS-S)為模板，經(jīng)