產(chǎn)黃青霉突變體庫的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、青霉素是抗生素領(lǐng)域重要戰(zhàn)略品種之一，產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)是生產(chǎn)青霉素的真菌，具有極其重要的工業(yè)價值。目前工業(yè)上使用的菌株是P.chrysogenumNRRL1951經(jīng)多輪誘變育種得來的，青霉素產(chǎn)量較原始出發(fā)菌已提高了近千倍，因此目前傳統(tǒng)的菌種改造和發(fā)酵調(diào)控難以使P.chrysogenum的青霉素水平有較大提高。為了獲得更高的產(chǎn)量，應(yīng)用基因工程技術(shù)將P.chrysogenum改良成為適于青霉素工業(yè)生產(chǎn)

2、成為目前的主要研究任務(wù)。本實驗旨在應(yīng)用基因工程技術(shù)改良P.chrysogenum工業(yè)菌株，以期在原有青霉素產(chǎn)量上有所突破，使青霉素產(chǎn)量提高。
　　本實驗采用工業(yè)產(chǎn)黃青霉(P.chrysogenum)為出發(fā)菌株，應(yīng)用原生質(zhì)體融合法將外源博來霉素抗性基因通過PCR合成的T-DNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)化產(chǎn)黃青霉(P.chrysogenum)，通過抗生素平板篩選獲得大量轉(zhuǎn)化子，為篩選青霉素高產(chǎn)突變株奠定了基礎(chǔ)。為確定外源基因是否導(dǎo)入，采用簡便的高通量基

3、因組提取方法，以酶解法為基礎(chǔ)，結(jié)合超聲處理與高溫加熱處理的方式，提出較高質(zhì)量的基因組DNA，后進(jìn)行PCR反應(yīng)。結(jié)果表明應(yīng)用混合酶液酶解效果最佳，其中蝸牛酶終濃度6 mg/mL纖維素酶終濃度4000 U/mL，超聲處理10-15 min，28℃酶解14h，最后90-98℃加熱10-15 min，然后加入50-100μLddH2O混勻，靜置直至分層，取上清直接PCR，得到了清晰準(zhǔn)確的條帶。
　　對所構(gòu)建的P.chrysogenum突變