大白菜EMS突變體庫的創(chuàng)建與篩選鑒定.pdf

1、大白菜（Brasscia campestris ssp.pekinensis L.）是蕓薹屬蔬菜作物，與模式生物擬南芥同屬十字花科，基因組存在高度相似性。大量的擬南芥基因功能信息的闡明，為開展白菜基因組學(xué)研究架起了橋梁。隨著大白菜全基因組測(cè)序工作順利完成和相應(yīng)BRAD數(shù)據(jù)庫的成功構(gòu)建，大白菜功能基因組學(xué)研究將成為重要的研究領(lǐng)域之一。構(gòu)建飽和變異的突變體庫、創(chuàng)造一定規(guī)模的TIILING群體，成為當(dāng)前合理利用這些有效資源，實(shí)現(xiàn)大白菜功能基因

2、深入系統(tǒng)研究的最有效方法之一。
　　本研究以優(yōu)質(zhì)大白菜自交系為對(duì)象，從構(gòu)建突變體庫材料的選擇、適宜誘變劑劑量和誘變方法的實(shí)施、突變體表型變異的分析、突變庫突變頻率的篩選與評(píng)估等方面進(jìn)行了研究。在構(gòu)建大白菜突變體庫的基礎(chǔ)上，建立了突變體的高效篩選技術(shù)體系。將TILLING技術(shù)、HRM技術(shù)與大白菜突變體的構(gòu)建篩選相結(jié)合，集成了人工高效誘變、DNA混合建池、高通量檢測(cè)等技術(shù)手段，使突變體庫的篩選鑒定能夠在基因水平定向化和技術(shù)平臺(tái)規(guī)?；?/p>

3、體系上實(shí)現(xiàn)。旨在拓寬大白菜遺傳背景，為大白菜功能基因組研究和新品種選育提供基礎(chǔ)材料。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1)在構(gòu)建突變體庫適宜材料的選擇上，通過對(duì)10個(gè)大白菜自交系的自交親和性、小孢子培養(yǎng)出胚成活率和綜合表型性狀的多個(gè)因素統(tǒng)計(jì)分析，確定構(gòu)建突變體庫的最佳基因型為:自交親和、小孢子培養(yǎng)出胚率高且綜合性狀良好的高代自交系‘A03’。
　　2)在EMS種子誘變處理方面，進(jìn)行了EMS“浸泡+間隔震蕩”和“浸泡+持續(xù)震

4、蕩”的兩種處理方法的對(duì)比，結(jié)果表明“浸泡+間隔震蕩”處理重復(fù)性好、機(jī)械損傷少，為適宜的誘變處理方式;在EMS誘變劑量、處理時(shí)間及高效誘變方面，通過對(duì)不同EMS誘變處理下M1和M2種子發(fā)芽率、成活率、活力指數(shù)，幼苗的長(zhǎng)勢(shì)、過氧化酶類(POD、SOD、CAT)的酶活性、MDA含量，并結(jié)合M1自交結(jié)籽能力和M2植株的成活情況等多個(gè)因素的綜合分析。最終，確定適宜的誘變方案為:清水浸種2h后，以濃度0.4％ EMS“浸泡+間隔震蕩”處理種子16h

5、。連續(xù)誘變處理兩代大白菜種子，可明顯提高突變頻率。
　　3)采取EMS種子誘變1次、種子誘變2次及花蕾誘變結(jié)合小孢子培養(yǎng)的方法，成功建立了高效獲得大白菜突變體庫的技術(shù)體系;構(gòu)建了含有4253個(gè)家系及其相應(yīng)自交M2種子的大白菜突變體庫，并且構(gòu)建了一個(gè)含有4004個(gè)M1家系的7756個(gè)突變單株的M2篩選群體。
　　4)對(duì)突變體庫M2群體的苗期、蓮座期、結(jié)球期、收獲期、生殖生長(zhǎng)階段及種子等不同時(shí)期的表形變異進(jìn)行調(diào)查。在6404株M

6、2幼苗中，共發(fā)現(xiàn)2409個(gè)變異幼苗，變異頻率為37.61％;在7756個(gè)M2蓮座期植株中，共發(fā)現(xiàn)了2042株變異材料，變異率為26.33％;在1677株M2結(jié)球期植株中，共發(fā)現(xiàn)363株變異材料，變異頻率為21.65％;在544個(gè)M2單株葉球的縱切面調(diào)查中，共發(fā)現(xiàn)121株變異材料，變異頻率為22.24％，變異以中心柱縱切面形狀變異為主;對(duì)6490個(gè)M2單株進(jìn)行抗寒性篩選，獲得382株抗寒性較強(qiáng)的植株，變異頻率為5.89％;對(duì)960株M2單

7、株進(jìn)行生殖生長(zhǎng)階段表型變異的調(diào)查中，發(fā)現(xiàn)含有整株或部分變異的植株數(shù)量高達(dá)230株，變異頻率為23.96％;在M2種子調(diào)查中還發(fā)現(xiàn)了種皮顏色、大小等變異類型。
　　5)在7756個(gè)M2群體植株中隨機(jī)選取了4224個(gè)單株進(jìn)行DNA的提取，采用8倍DNA混池技術(shù)構(gòu)建了48個(gè)的DNA池和6個(gè)DNA濃度均一的混合池;針對(duì)3個(gè)生長(zhǎng)素及結(jié)球相關(guān)基因，設(shè)計(jì)篩選獲得了16對(duì)特異性引物，對(duì)DNA混合池和一級(jí)池分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用HRM技術(shù)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)