蘋果砧木耐鹽突變體的篩選及其鑒定.pdf

1、蘋果是重要的果樹樹種之一，主要靠嫁接繁殖，其耐鹽性主要取決于砧木。因此，選擇利用具有較高耐鹽能力的砧木是提高蘋果耐鹽性的關(guān)鍵。利用組織培養(yǎng)與誘變技術(shù)相結(jié)合選育抗性突變體，可提高耐鹽砧木育種效率，獲得優(yōu)良的新種質(zhì)。但是經(jīng)誘變和耐鹽性反復(fù)篩選而獲得的突變體，不排除部分個(gè)體是由環(huán)境脅迫而產(chǎn)生的適應(yīng)性改變，而并非穩(wěn)定的遺傳變異。因此，突變體的鑒定是誘變育種的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。 本試驗(yàn)以蘋果砧木78-48和EH-78-48為材料，以NaCl作

2、為耐鹽選擇劑，采用輻射誘變和組織培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合的方法，對蘋果耐鹽突變體的篩選及其鑒定進(jìn)行了系統(tǒng)研究。主要研究結(jié)果如下： 1.建立了78-48和EH-78-48的高效葉片再生體系，再生培養(yǎng)基為MS+BA2.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1或MS+TDZ1.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1，暗培養(yǎng)時(shí)間20d最佳。 2.60Co-γ輻射誘變明顯抑制了78-48和EH-78-48植株的生長，誘變處理后兩砧木畸形葉

3、比例增加，葉片再生受到明顯抑制。 3.選取誘變效應(yīng)明顯的植株葉片進(jìn)行再生，采用NaCl1.0﹪和1.2﹪作為選擇壓，對再生植株進(jìn)行多代交替鹽篩選，獲得了耐鹽性穩(wěn)定的突變株系L和K。 4.對78-48及其耐鹽突變體L1、L2、EH-78-48及其耐鹽突變體K2的形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行觀察和測定，結(jié)果表明：耐鹽突變體的存活率明顯高于對照，受害率和受害指數(shù)低于對照，表現(xiàn)出較高的耐鹽性。受害指數(shù)能夠綜合反映蘋果砧木的鹽害程度，能較準(zhǔn)確地反

4、映出鹽脅迫對砧木的生長抑制作用，可作為描述蘋果砧木耐鹽性的形態(tài)學(xué)指標(biāo)。 5.研究結(jié)果表明在鹽脅迫條件下，蘋果砧木細(xì)胞膜透性加大，MDA、O2-和Cl-含量升高，在處理期間耐鹽突變體上述指標(biāo)含量均顯著低于對照，兩者之間差異顯著；SOD和POD酶活性、脯氨酸含量增加，在處理期間耐鹽突變體明顯高于對照，兩者之間差異顯著。Na+含量在鹽脅迫條件下升高，K+含量降低，Na+/K+增大，但耐鹽突變體的Na+/K+低于對照水平，說明突變體比對

5、照更能忍受鹽脅迫的傷害。 6.在鹽脅迫條件下，蘋果砧木耐鹽突變體內(nèi)多胺總量和精胺、亞精胺、腐胺含量都表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，腐胺含量表現(xiàn)為先下降后上升的趨勢，(Spd+Spm)/Put比值隨著鹽濃度的增加而升高。研究發(fā)現(xiàn)，不管是多胺總量、精胺、亞精胺、腐胺含量，還是(Spd+Spm)/Put比值，耐鹽突變體都顯著高于對照。 7.在鹽脅迫條件下，蘋果砧木體內(nèi)IAA、GA和ZR含量和ZR/ABA比值逐漸降低；ABA含量增加

6、，耐鹽突變體ABA含量明顯高于對照。 8.上述指標(biāo)的相關(guān)分析結(jié)果表明，MDA含量、超氧陰離子含量、Cl-含量、SOD活性、脯氨酸含量增加，與質(zhì)膜透性的增加呈正相關(guān)，ABA含量與質(zhì)膜透性雖也呈正相關(guān)，但相關(guān)系數(shù)較低；突變體的POD活性和多胺含量與質(zhì)膜透性呈正相關(guān)，而對照與質(zhì)膜透性的相關(guān)系數(shù)較低。因此，認(rèn)為質(zhì)膜透性、超氧陰離子含量、Cl-含量、SOD活性可作為耐鹽性的鑒定指標(biāo)。 9.本研究對78-48及其耐鹽突變株系進(jìn)行了R

7、APD分析，結(jié)果表明在36個(gè)引物中有32個(gè)引物有多態(tài)性擴(kuò)增，對5個(gè)材料基因組的546個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了檢測。發(fā)現(xiàn)78-48的突變株系L1、L2多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)分別為40和38個(gè)，EH-78-48的突變株系K2的多態(tài)性位點(diǎn)為37個(gè)。對2個(gè)砧木及其各突變株系的多態(tài)性和遺傳背景進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明各突變株系與對照相比在DNA分子水平上發(fā)生了變異。 10.對RAPD分析中檢測到的多態(tài)性片斷進(jìn)行克隆測序分析。結(jié)果表明，隨機(jī)引物S174、S373可

8、做為耐鹽性標(biāo)記。EH-78-48和突變株系L2、K2與原品種相比，確實(shí)在DNA水平發(fā)生了突變，并且證實(shí)突變與耐鹽相關(guān)。L1雖然在生理生化和形態(tài)學(xué)指標(biāo)上表現(xiàn)出較高的耐鹽性，在DNA水平上也檢測到了突變，但克隆測序分析表明，L1擴(kuò)增到的多態(tài)性片斷與耐鹽不相關(guān)，這說明檢測到的突變可能與其它性狀有關(guān)，或者是引物篩選量過低造成的，其突變是否與耐鹽有關(guān)還需進(jìn)一步證實(shí)。 11.對供試材料進(jìn)行AFLP分析表明，10對引物組合中有2對引物可以區(qū)分