TEV蛋白酶突變體構(gòu)建及性質(zhì)分析.pdf

1、煙草蝕斑病毒蛋白酶具有較高作用序列專一性，主要用于切除融合標(biāo)簽，但是野生型蛋白酶在大腸桿菌中表達(dá)的可溶性不高，為此，本文構(gòu)建了1種氨基酸突變體和15種含有1個(gè)或多個(gè)精氨酸同義密碼子突變體，分析并比較了不同突變體蛋白的重組表達(dá)、部分突變的酶活性和專一性，獲得以下結(jié)果：
　　1.構(gòu)建了雙突變體(L56V/S135G)，表達(dá)的重組蛋白N端含有組氨酸標(biāo)簽，C端分別含有組氨酸標(biāo)簽，GFP報(bào)告蛋白，或 S-tag，分別用于檢測蛋白的水溶性表達(dá)

2、和利用Ni-NTA親和層析快速純化蛋白。
　　2.通過流式細(xì)胞儀檢測雙突變體的水溶性表達(dá)水平低于三突變體(T17S/N68D/I77V)和五突變體(T17S/L56V/N68D/I77V/S135G)，但高于野生型蛋白。提高誘導(dǎo)溫度后，和其它形式蛋白相比，二突變體蛋白酶活性不受影響，而其它突變體和野生型蛋白酶活降低。
　　3.純化了野生型和突變體蛋白，分析雙突變體蛋白酶的性質(zhì)，它的催化常數(shù)高于野生型蛋白酶，但低于三突變體和五

3、突變體，熱穩(wěn)定性僅低于五突變體，在2M的尿素和鹽酸胍存在下，蛋白酶活性保持最高。
　　4.在1mM IPTG和37℃誘導(dǎo)后，大腸桿菌所有構(gòu)建的蛋白酶表達(dá)幾乎為包涵體，但是共表達(dá)分子伴侶后，二突變體恢復(fù)的表達(dá)水平最高。
　　5.在五突變體基礎(chǔ)上，構(gòu)建了15個(gè)精氨酸同義密碼子突變體，用大腸桿菌優(yōu)先表達(dá)的密碼子取代編碼蛋白酶的稀有密碼子，同時(shí)構(gòu)建了 C端含有 GFP，以及部分突變體含C端S-tag的融合表達(dá)載體。
　　6.利

4、用SDS-PAGE、蛋白印跡和GFP熒光強(qiáng)度檢測蛋白在上清和沉淀中表達(dá)，重組突變體顯示不同的差異性表達(dá)，同義突變對蛋白的可溶性表達(dá)和蛋白折疊都有影響。
　　7.利用大腸桿菌 RosettaTM(DE3)菌株提高內(nèi)源稀有 tRNA表達(dá)水平，能提高個(gè)別突變體可溶性表達(dá)，但同時(shí)也降低一些突變體的水溶性表達(dá)。利用C-端的融合 S-tag檢測到一些突變體蛋白表達(dá)為包涵體是由于蛋白翻譯速度增加所致。
　　8.純化了部分突變體蛋白，電泳顯