CUEDC2各種缺失突變體的構(gòu)建及其功能初探.pdf

1、中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院碩士學(xué)位論文CUEDC2各種缺失突變體的構(gòu)建及其功能初探姓名：王晨輝申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：細(xì)胞生物學(xué)指導(dǎo)教師：張學(xué)敏20070510摘要CUEDC2各種缺失突變體的構(gòu)建及其功能初探摘要CUEDC2是一個(gè)未知功能的蛋白(GeneBank：NM_024040)，在NCBI數(shù)掘庫(kù)沒有與其功能相關(guān)的研究論文。本室其他同學(xué)在以往的研究中利用酵母雙雜交篩選出CUEDC2與PRB存在相互作用，并且發(fā)現(xiàn)CUEDC2能夠促進(jìn)

2、PRB的泛素化降解，為研究CUEDC2的功能提供了線索。本室其他同學(xué)利用CUEDC2作為誘餌進(jìn)行酵母雙雜交篩選中鑒定了多個(gè)陽(yáng)性克隆，其中兩個(gè)編碼IKK[3。為了驗(yàn)證酵母雙雜交的結(jié)果，以及確定CUEDC2與IKKl3的相互作用區(qū)域，我們首先在GST載體上構(gòu)建了許多CUEDC2的缺失突變。由于CUEDC2只含有CUE結(jié)構(gòu)域“?！?，因此初步構(gòu)建TCUEDC2的C末端和N末端以及包含和不包含CUE結(jié)構(gòu)域的突變體。之后為了確定CUEDC2影響NF

3、—KB信號(hào)通路的具體區(qū)域，又進(jìn)一步將CUEDC2的各種缺失突變構(gòu)建塑JpCDNA3OFlag載體上。并構(gòu)建了IKKB的一些缺失突變。其次，我們利用體外的GSTpul卜down實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了CUEDC2與IKKJ3之間的相互作用。我們發(fā)現(xiàn)CUEDC2與IKKct之間也存在相互作用。隨后，我們利用CUEDC2的缺失突變，通過體外GSTpul卜down實(shí)驗(yàn)確定CUEDC2與IKKa的結(jié)合位點(diǎn)在CUEDC2的C未端。由于IKK是NF—KB信號(hào)通路中

4、非常重要的蛋白““”，我們推測(cè)CUEDC2會(huì)影響NF—KB的轉(zhuǎn)錄活性。為確定CUEDC2和IKKa／r3相互作用的生物學(xué)意義，我們?cè)谡婧思?xì)胞中建立了一套NF—KB轉(zhuǎn)錄激活熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)。測(cè)活結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)CUEDC2可以特異地抑制TNFa刺激的NF—KB轉(zhuǎn)錄活性。這一現(xiàn)象在Hela細(xì)胞中得到了驗(yàn)證。我們用IL—lplJ激HEK293細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)CUEDC2也能夠抑制IL一1p刺激的NF—KB轉(zhuǎn)錄活性。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CUEDC2的HEK