家貓血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2基因的cDNA克隆、表達(dá)、生物信息學(xué)分析及其組織分布研究.pdf

1、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin-convertingenzyme2，ACE2)是一種金屬蛋白酶，它廣泛存在于人及動(dòng)物的心臟、肝臟、肺臟、腎臟、睪丸以及腸道等主要器官中，在調(diào)節(jié)心臟、腎臟功能及控制血壓中起到非常關(guān)鍵的作用，也有研究報(bào)道ACE2基因參與糖尿病腎病的病理發(fā)展，同時(shí)在睪丸組織的特異性表達(dá)被認(rèn)為可能也參與了生殖能力的調(diào)節(jié)。最近發(fā)現(xiàn)，ACE2是嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒(severeacuterespiratorys

2、yndromeassociatedcoronavirus，SARS-CoV)的功能性受體。 SARS-CoV的纖突(Spike，S)蛋白能特異識(shí)別靶細(xì)胞上的ACE2蛋白并與之結(jié)合，從而介導(dǎo)病毒侵入靶細(xì)胞。業(yè)已發(fā)現(xiàn)除了人以外，恒河猴、果子貍、家貓、雪貂都是SARS-CoV的易感動(dòng)物，小鼠、大鼠、果子貍等動(dòng)物的ACE2同樣能介導(dǎo)SARS-CoV感染細(xì)胞。有研究表明，多種Ⅰ和Ⅲ型冠狀病毒都能夠利用家貓中的特異受體從而侵入靶細(xì)胞。這些現(xiàn)

3、象都說(shuō)明家貓有可能在冠狀病毒跨種感染以及新冠狀病毒的衍生過(guò)程中起到重要作用。ACE2蛋白是2000年才鑒定出來(lái)的一種新蛋白，對(duì)其功能結(jié)構(gòu)還缺乏徹底了解。目前僅對(duì)人、小鼠ACE2蛋白有深入研究，對(duì)家貓ACE2的研究仍屬空白。 本研究克隆并表達(dá)了家貓ACE2基因，并對(duì)其編碼蛋白的理化性質(zhì)、功能結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)了ACE2在各主要組織器官中的表達(dá)情況，并對(duì)部分基因進(jìn)行了表達(dá)研究，具體研究?jī)?nèi)容如下： 根

4、據(jù)已經(jīng)報(bào)道的人及小鼠的ACE2基因mRNA序列設(shè)計(jì)引物，從家貓肺臟總RNA中分段擴(kuò)增出家貓ACE2基因mRNA編碼區(qū)序列。序列分析結(jié)果表明，家貓ACE2基因mRNA編碼區(qū)序列長(zhǎng)2418bp，所編碼的蛋白含805個(gè)氨基酸殘基。經(jīng)序列比較發(fā)現(xiàn)，家貓ACE2基因mRNA編碼區(qū)序列與人、小鼠及大鼠ACE2基因mRNA編碼區(qū)序列的同源性分別為86％、84％和84％，氨基酸同源性分別為85％、81％和81％。 利用生物信息學(xué)方法對(duì)家貓ACE

5、2蛋白的物理化學(xué)性質(zhì)、信號(hào)肽、跨膜螺旋、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、基序以及蛋白質(zhì)家族進(jìn)行預(yù)測(cè)，同時(shí)綜合各工具的預(yù)測(cè)結(jié)果對(duì)家貓ACE2蛋白的各方面性質(zhì)進(jìn)行了分析。與其它幾種動(dòng)物的ACE2相比，貓ACE2的SARS-CoV結(jié)合功能區(qū)氨基酸與人的同源性最高，提示貓可能在SARS-CoV的傳播中起重要作用。 通過(guò)RT-PCR方法，檢測(cè)家貓各組織器官中ACE2蛋白的表達(dá)分布，證實(shí)家貓主要組織器官中ACE2的表達(dá)分布與已經(jīng)報(bào)道的人體分布

6、情況一致。 通過(guò)對(duì)信號(hào)肽、跨膜螺旋的預(yù)測(cè)，再設(shè)計(jì)了一對(duì)引物特異性擴(kuò)增信號(hào)肽與跨膜螺旋之間的片段。進(jìn)一步構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-ACE2，在大腸桿菌BL21(DE3)plysS中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，融合蛋白分子量約為85kD。 通過(guò)WesternBlot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，家貓ACE2蛋白原核表達(dá)產(chǎn)物能夠與羊抗人ACE2蛋白多克隆抗體交叉反應(yīng)。 綜上所述，本論文克隆鑒定了貓ACE2基因編碼區(qū)序列，證明貓ACE2與人ACE2具有相似的