小鼠內(nèi)皮抑素基因突變體的克隆表達(dá)及功能的初步研究.pdf

1、大連醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文小鼠內(nèi)皮抑素基因突變體的克隆表達(dá)及功能的初步研究姓名：黃曉華申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)指導(dǎo)教師：左云飛20050601p B V 2 2 0 ．E M 7 與p B V 2 2 0 ．E n d o s t a t i n 轉(zhuǎn)入大腸桿菌D H 5 a 中，初步分離純化表達(dá)蛋白并進(jìn)行體外活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)改性后內(nèi)皮抑素的活性，通過(guò)與全長(zhǎng)內(nèi)皮抑素的比較研究去除c 末端的氨基酸是否會(huì)影響內(nèi)皮抑素的抗血管活性。為此

2、作了以下工作：1 ．以本教研室保存的質(zhì)粒表達(dá)載體p B V 2 2 0 ．E n d o s t a t i n 為模板，設(shè)計(jì)合成的一對(duì)分別帶有B a m H I 和E c o R I 的限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的特異性引物，P C R 法擴(kuò)增E M 7 基因片段并引入上述兩個(gè)酶切位點(diǎn)。2 ．用B a m HI 和E c o R I 酶切P C R 產(chǎn)物及p B V 2 2 0 ，將目的基因插入質(zhì)粒p B V 2 2 0 中，構(gòu)建重組質(zhì)粒p

3、 B V 2 2 0 ．E M 7 ，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌D H 5 a 中并篩選陽(yáng)性克隆，用雙脫氧末端終止法測(cè)序，結(jié)果表明與已知小鼠內(nèi)皮抑素C 末端去除2 1 個(gè)堿基的基因序列一致。3 。用溫度誘導(dǎo)重組質(zhì)粒p B V 2 2 0 ．E M 7 、p B V 2 2 0 ．E n d o s t a t i n 在宿主菌中表達(dá)外源蛋白。并用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物。4 ．將表達(dá)蛋白初步分離純化，并利用初步純化的蛋白進(jìn)行雞胚絨毛

4、膜尿囊實(shí)驗(yàn)( C A M ) 。結(jié)果表明重組質(zhì)粒p B V 2 2 0 ．E M 7 、p B V 2 2 0 ．E n d o s t a t i n 在宿主菌中表達(dá)的外源蛋白均可在C A M 實(shí)驗(yàn)中抑制新血管的生成。本實(shí)驗(yàn)成功克隆了E M 7 基因，構(gòu)建了重組質(zhì)粒p B V 2 2 0 ．E M 7 ，并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌D H 5 a 中。誘導(dǎo)改性后內(nèi)皮抑索及完整的內(nèi)皮抑素蛋白的表達(dá)，并對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行初步純化。通過(guò)C A M