水稻雄配子不育突變體的遺傳分析及功能基因克隆.pdf

1、水稻是世界上最重要的糧食作物之一，也是植物分子生物學研究的良好單子葉植物模式生物。近年來，轉(zhuǎn)基因水稻被廣泛的研究應用。然而，由于轉(zhuǎn)基因的遺傳及表達的不穩(wěn)定性和不可預知性，轉(zhuǎn)基因引起的水稻雌雄配子體發(fā)育問題使許多轉(zhuǎn)基因水稻株系在育種上無法利用。因此，開展水稻花粉發(fā)育突變體篩選、相關功能基因克隆及研究不僅對水稻花粉發(fā)育及相關的基礎生物學研究具有重要的理論意義，而且對雜交稻及水稻轉(zhuǎn)基因育種具有重要的實際意義。 本文通過對多216個候選

2、株系進行外源標記基因的遺傳分析，結(jié)合花粉細胞學觀察和外源基因表達定量分析，建立了具有38個株系的水稻T-DNA插入雄配子不育突變體群體：借助TAIL-PCR技術，已獲得22個雄配子體突變體中轉(zhuǎn)基因插入位點側(cè)翼序列的分子特征信息。選取了2個候選基因進行了基因克隆和相關表達載體的構(gòu)建，獲得了相應表達載體的轉(zhuǎn)基因植株。獲得的主要研究結(jié)論有： 1、對篩選到216個自交后代外源標記基因能夠穩(wěn)定保持1:1分離的轉(zhuǎn)基因水稻株系采用測交和/或雜

3、交方法檢測外源標記基因(hpt基因)的遺傳規(guī)律，初步確定其中57個株系為雄配子不育候選突變體，39個株系為雌配子不育候選突變體。對上述雄配子不育候選突變體，通過多代測交和/或雜交方法進行外源標記基因的遺傳分析，結(jié)合花粉細胞學觀察和外源基因表達定量分析，建立了一個包含38個突變體的水稻T-DNA插入雄配子不育突變體群體。 2、利用TAIL-PCR獲得了22個水稻雄配子不育T-DNA插入突變體的側(cè)翼序列，依據(jù)BLAST結(jié)果及注釋信息

4、，發(fā)現(xiàn)有15個不同的插入位點，存在多個突變體插入相同位點或區(qū)域的現(xiàn)象，暗示了可能存在插入熱點。12個插入位點位于基因區(qū)或基因調(diào)控區(qū)，獲得了數(shù)個候選基因。 3、利用我們先前獲得到序列信息，選擇了其中2個候選基因(1個WRKY鋅指轉(zhuǎn)錄因子和1個未知保守蛋白)的啟動子序列和其中未知保守蛋白基因序列，以pCAMBIA1300為骨架分別構(gòu)建了這兩個候選基因上游啟動子區(qū)與GUS基因融合的表達載體p1300JM1P和p1300JM6P。基于未