家蠶新突變體4齡幼蟲致死基因的定位克隆及功能研究.pdf

1、家蠶是一種完全變態(tài)昆蟲，幼蟲期是其整個生活史中生長發(fā)育和儲存能量的重要階段，因此幼蟲期致死對家蠶生命周期的影響無疑是巨大的，同時也會對養(yǎng)蠶生產(chǎn)造成嚴重的經(jīng)濟損失。4齡幼蟲致死突變（lethal mutant in the fourth instar larvae，l-4i）是一種新的幼蟲期致死的突變體，本研究在對l-4i突變體遺傳分析的基礎上，采用圖位克隆技術對l-4i的突變基因進行了定位克隆，構建了遺傳連鎖圖，采用qRT-PCR、RN

2、Ai、酶活測定和添食特異性抑制劑方法對突變基因進行表達分析和功能驗證，證實了家蠶拓撲異構酶基因Bmtop的突變是導致l-4i突變體的主要原因，為進一步研究l-4i突變體致死的分子機制奠定了基礎。主要研究成果如下：
　　一、l-4i突變體的表型特征與遺傳分析
　　4齡幼蟲致死突變（lethal mutant in the fourth instar larvae，l-4i）是在對家蠶品種P33的飼養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)的一種新的幼蟲期致

3、死型突變體，其特征為l-4i突變體幼蟲在3齡第2天就表現(xiàn)出體型較正常個體小，活力較差，生長發(fā)育緩慢的特征，3齡期延長約2天，4齡起蠶后極少進食，生長發(fā)育基本停滯，并于4齡第3~4天陸續(xù)死亡。遺傳分析初步判斷該突變體由常染色體上的一個隱性遺傳基因控制，且為同質(zhì)型（l-4il-4i）致死。
　　二、l-4i突變基因的連鎖及定位分析
　　根據(jù)l-4i突變體的遺傳規(guī)律可以得出該突變性狀是由隱性純合基因控制的，由于l-4i/l-4i有

4、致死性，我們采用基因型為+/l-4i的雄蛾親本（P2）與C108的雌性親本（P1）雜交，通過一雄交二雌的方法組配并篩選雜合型F1代群體；篩選出的F1代個體進行自交或與4齡幼蟲致死突變體系統(tǒng)中有性狀分離的蛾區(qū)的親本進行正反交回交分別組配F2代，BC1F和BC1M群體。然后用P1、F1和P2篩選了家蠶28個連鎖群上具有多態(tài)性的SSR分子標記；用約400個BC1F、BC1M和F2代群體確定l-4i突變基因所在的連鎖群并進行精細定位。連鎖分析結

5、果顯示l-4i的突變基因位于家蠶第17連鎖群；定位結果顯示突變基因位于S2865-204和S2865-148兩個多態(tài)性標記之間，相距約320kb，包含有18個候選基因。
　　三、l-4i突變基因的鑒定
　　采用RT-PCR方法對位于目標區(qū)域內(nèi)候選基因的轉(zhuǎn)錄水平進行了檢測但沒有找到有明顯表達差異的基因，繼而又對區(qū)域內(nèi)18個基因的ORF采取克隆測序以期查找差異基因，結果發(fā)現(xiàn)大部分基因的ORF沒有差異，只有BMgn007081基因

6、的ORF在突變體l-4i中存在兩處缺失：在1430-1477位置處缺失48個堿基，在2566位置發(fā)生單堿基缺失。
　　RNAi初步對BMgn007081基因進行功能驗證，結果顯示干擾該基因后家蠶出現(xiàn)生長緩慢，食桑少，蠶體較小，活力較差的表型，進入眠期的時間比對照組晚約24小時左右，且后期有的家蠶幼蟲陸續(xù)開始死亡，這與l-4i突變體的表型類似，因此初步判斷BMgn007081基因突變是導致l-4i突變體的主要原因。
　　利用熒

7、光定量PCR對BMgn007081基因即家蠶拓撲異構酶基因（Bmtop）在家蠶不同組織和不同發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄水平進行了檢測，獲得了該基因的組織表達譜和齡期表達圖譜，發(fā)現(xiàn)該基因在家蠶體內(nèi)幾乎所有組織和發(fā)育時期都有表達，這說明該基因是家蠶體內(nèi)的重要功能基因，這也從側面為突變基因的鑒定提供了有力證據(jù)。
　　四、l-4i突變基因的功能驗證
　　家蠶基因組數(shù)據(jù)庫中對BMgn007081基因的注釋為該基因編碼一種家蠶拓撲異構酶III，屬于

8、拓撲異構酶IA家族。為了進一步驗證該突變基因的功能，通過對野生型家蠶在不同發(fā)育齡期添食40 mg/kg、80 mg/kg和160 mg/kg濃度的拓撲異構酶I抑制劑喜樹堿（Camptothecin，CPT），觀察家蠶生長發(fā)育狀況。實驗結果顯示，添食喜樹堿后家蠶表現(xiàn)出生長遲緩，蠶體較小，且后期開始陸續(xù)死亡，這與l-4i突變體的自然突變表型非常一致。
　　此外我們考察拓撲異構酶在野生型家蠶和l-4i突變體體內(nèi)的酶活力差異，同時也了檢測

9、添食不同濃度CPT的家蠶體內(nèi)酶活力的變化情況。實驗結果顯示，l-4i突變體中拓撲異構酶活性遠低于野生型家蠶，添食CPT家蠶體內(nèi)的酶活力也低于對照組家蠶，且隨著CPT濃度的增加家蠶體內(nèi)拓撲異構酶酶活力呈現(xiàn)出遞減的趨勢。綜合上述實驗結果判定家蠶l-4i突變體體內(nèi)的拓撲異構酶編碼區(qū)缺失而導致酶活力降低是導致l-4i突變體發(fā)生并死亡的主要原因。
　　上述研究證實了家蠶拓撲異構酶基因Bmtop的突變是導致l-4i突變體產(chǎn)生的主要原因，該研究