稻曲病菌突變體庫的構(gòu)建及其HOG1基因的克隆和功能初步分析.pdf

1、稻曲病菌是水稻重要的致病真菌，引起的稻曲病是水稻上的重要穗部病害。研究表明，許多植物病原真菌的生長、發(fā)育及致病性都受到細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控，其中MAPK(mitogen-activated protein kinase)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是普遍存在的并有重要調(diào)控作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。深入研究稻曲病菌發(fā)育、致病分子機(jī)理對于防治稻曲病有著重要意義。
　　 本文建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的稻曲病菌轉(zhuǎn)化技術(shù)，成功獲得兩個(gè)生長缺陷突變體T18和T39，從

2、中鑒定和分析了T18的T-DNA插入標(biāo)記的基因。本文還通過同源克隆的方法克隆了稻曲病菌HOG1基因，并對其功能進(jìn)行初步的分析。主要結(jié)果如下:
　　 1.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，分析了18S核糖體RNA基因（18S rRNA）、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH)、多聚泛素酶基因（ubiquitin）、β-肌動(dòng)蛋白基因（β-actin）、α微管蛋白基因(α-tubulin)等5個(gè)基因的表達(dá)情況。經(jīng)geNorm軟件統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處

3、理，結(jié)果表明，當(dāng)利用熒光定量PCR分析比較稻曲病菌基因表達(dá)差異時(shí)，可選擇α-tubulin和β-actin作為內(nèi)參基因。
　　 2.通過優(yōu)化各種轉(zhuǎn)化條件，建立了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)稻曲病菌的高效遺傳轉(zhuǎn)化體系。本研究采用此轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建了含有1000多個(gè)轉(zhuǎn)化子的稻曲病菌T-DNA插入突變體庫，為以后的稻曲病菌基因功能研究奠定了一定的基礎(chǔ)。本研究通過形態(tài)觀察篩選出2株變異較大的突變菌株T18和T39，這兩個(gè)突變菌株在生長速度、產(chǎn)孢量、孢子萌

4、發(fā)率等方面與野生型相比存在明顯缺陷。另外，利用TAIL-PCR技術(shù)對T18側(cè)翼序列進(jìn)行擴(kuò)增得到約1800 bp右邊界序列，比對和預(yù)測結(jié)果表明該插入為點(diǎn)為細(xì)胞色素c氧化酶V的啟動(dòng)子區(qū)域，但該基因的具體功能還需進(jìn)一步的研究。
　　 3.根據(jù)幾種絲狀真菌Hog1 MAPK的保守氨基酸序列設(shè)計(jì)簡并引物，從稻曲病菌中擴(kuò)增出MAPK同源基因的部分片段，然后利用RACE法延伸該片段的側(cè)翼序列，獲得MAPK編碼基因的全長序列，命名為UvHog1

5、。序列分析表明，該基因編碼358個(gè)氨基酸的多肽，推測分子量為40.98kDa，等電點(diǎn)為5.63。UvHog1含有MAPK保守的蛋白激酶激活域(TGY)，序列與稻瘟病MgOsml(AAF09475.1)、球孢白僵菌BbHog1(AAS77871.1)、煙曲霉AfOsm1(XP752664.1)和隱球酵母CrHog1(AAM26267.1)等Hog1 MAPK高度同源，相似性分別為95％、93％、88％和81％。系統(tǒng)聚類結(jié)果表明，UvHog