SARS-CoV S1基因的巴斯德畢赤酵母表達(dá)及阻斷多肽的研究.pdf

1、嚴(yán)重急性呼吸道綜合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）又稱“非典型性肺炎”，或“非典”，主要表現(xiàn)為肺炎及漸進(jìn)性呼吸衰竭，死亡率為10％左右。它于2002年11月在中國廣東省首先爆發(fā)，然后迅疾傳播至全球32個(gè)國家及地區(qū)，其病原為一種新的冠狀病毒（SARS associated coronavirus，SARS-CoV）。目前尚無特效藥物用于SARS治療，正在研究的各種抗病毒方法包括：用模擬受體

2、分子或病毒的受體結(jié)合蛋白封閉病毒受體相互作用、用小肽分子抑制病毒與細(xì)胞膜間的融合、用特定中和表位研制亞單位疫苗等。SARS-CoV刺突蛋白S1是與病毒主要受體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（angiotensin convening enzyme 2，ACE2）相結(jié)合的病毒蛋白，其受體結(jié)合功能區(qū)包括在第318-510個(gè)氨基酸殘基間的193個(gè)氨基酸片段內(nèi)，該片段同時(shí)包含多個(gè)中和表位。本研究通過克隆表達(dá)SARS-CoV的S1蛋白受體結(jié)合區(qū)，用表達(dá)的S1

3、蛋白為靶蛋白，從噬菌體展示隨機(jī)肽庫中篩選特異性結(jié)合多肽，篩選阻斷多肽。為進(jìn)一步研究病毒致病機(jī)理及抗病毒藥物奠定了基礎(chǔ)。 本研究通過對S1基因修飾，在編碼氨基酸不發(fā)生改變的前提下設(shè)計(jì)多對引物采用Over-Lap PCR對含有受體結(jié)合區(qū)的S1基因（777-1683，1041-1050，1236-1248，1317-1335，1590-1605）位存在的多個(gè)AT重復(fù)序列進(jìn)行核苷酸置換。修飾后的S1基因克隆于酵母表達(dá)載體pPIC9K中，

4、誘導(dǎo)上清經(jīng)過SDS-PAGE和Western Blot檢測，證實(shí)S1蛋白在巴斯德畢赤酵母中獲得了表達(dá)。紫外分光光度計(jì)測定S1蛋白在酵母表達(dá)產(chǎn)量為69mg/L，說明巴斯德畢赤酵母是一種適合S1蛋白表達(dá)的系統(tǒng)。表達(dá)的S1蛋白作為診斷抗原檢測人的陽性血清，ELISA結(jié)果證明了表達(dá)產(chǎn)物具有很好的免疫原性。 經(jīng)過飽和硫酸胺純化的S259-561蛋白作為靶蛋白，從十二肽庫中篩選與其特異性結(jié)合的多肽。經(jīng)過3輪篩選，并經(jīng)過ELISA分析，得到8