非洲綠猴腎細(xì)胞中SARS冠狀病毒受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2cDNA的克隆、表達(dá)及功能區(qū)的鑒定.pdf

1、2002年末至2003年春在世界范圍爆發(fā)的非典型肺炎給人們的正常生活產(chǎn)生了巨大的影響，也引起了各國科研工作者的高度關(guān)注。非典型肺炎是一種急性、高度接觸性的呼吸系統(tǒng)疾病，世界衛(wèi)生組織(WHO)于2003年3月15日將其正式定名為嚴(yán)重急性呼吸綜合征(severeacuterespiratorysyndrome，SARS)。目前已經(jīng)確定，冠狀病毒(coronavirus)的一個變種是引起SARS的病原體，并將其命名為SARS病毒(SARS-C

2、oV)。SARS-CoV的細(xì)胞受體已鑒定為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin-convertingenzyme2，ACE2)。盡管CD209L也被認(rèn)為是SARS-CoV的細(xì)胞受體，但血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)是SARS-CoV的主要功能性受體。ACE2是一種具有重要生物學(xué)功能的金屬蛋白酶。本研究旨在克隆鑒定ACE2，確定ACE2的受體功能域，為進(jìn)一步研究SARS-CoV與細(xì)胞的相互作用及跨種感染機(jī)制、研制抗病毒制劑等提供理論

3、依據(jù)與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 1.SARS-CoV受體ACE2在巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)本研究參照人ACE2的全基因序列合成兩對特異性引物，從SARS-CoV敏感細(xì)胞Vero-E6細(xì)胞的mRNA中分兩段擴(kuò)出ACE2基因，命名為(ACE2A：102nt～1210ntACE2B：1101nt～2524nt)，然后克隆到pMD-18T中，酶切鑒定后，用SnaBI和NotI酶切，將其插入畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9k中，得到的重組表達(dá)載體p9K-ACE

4、2A與p9K-ACE2B，轉(zhuǎn)化GS115感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)5天表達(dá)ACE2A、ACE2B蛋白，并分泌到胞外。SDS-PAGE分析顯示表達(dá)的蛋白大小約為41KD、52KD。Dot-blot結(jié)果表明表達(dá)蛋白具有良好的抗原性。這對于ACE2SARS-CoVS蛋白結(jié)合區(qū)的鑒定及SARS-CoV的臨床檢測都具有十分重要的意義，也為深入研究SARS-CoV與細(xì)胞受體的結(jié)合機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 2.SARS-CoV受體ACE2的原核表達(dá)及其功

5、能區(qū)的鑒定從Vero-E6細(xì)胞的mRNA中分兩段擴(kuò)出的ACE2基因(ACE2A：102nt～1210ntACE2B：1101nt～2524nt)，前段ACE2A1-367不包括ACE2的酶活性位點(diǎn)，后段ACE2B335-805包括ACE2的酶活性位點(diǎn)。構(gòu)建與GST基因融合表達(dá)的原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-ACE2A與pGEX-ACE2B，IPTG誘導(dǎo)下獲得高效表達(dá)。表達(dá)的融合蛋白分子量為65KD和77KD，主要以包涵體形式存在。Western

6、blot證實(shí)表達(dá)產(chǎn)物具有免疫學(xué)活性。將包涵體變性、復(fù)性后，經(jīng)Westernblot證實(shí)pGEX-ACE2A表達(dá)的蛋白(～65KD)能與SARS-CoVS1蛋白特異結(jié)合，而pGEX-ACE2B表達(dá)的蛋白(～77KD)不能與S1蛋白結(jié)合。此結(jié)論證實(shí)ACE2的受體活性與酶活性位點(diǎn)無關(guān)，受體功能區(qū)在ACE2N端335位氨基酸內(nèi)。該研究是目前表達(dá)的、具有受體活性的最小ACE2片段。 3.應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)預(yù)測SARS-CoVS蛋白的功能區(qū)

7、本研究采用噬菌體展示(phagedisplay)技術(shù)篩選與ACE2A(因?yàn)橐呀?jīng)鑒定出ACE2的功能區(qū)是ACE2A這一段)蛋白結(jié)合的短肽。ACE2A蛋白與GST融合蛋白應(yīng)用pGEX-KG載體系統(tǒng)表達(dá)，并通過提取包涵體純化。用濃度為100μg/mlACE2A-GST蛋白4℃下包被ELISA板過夜，并用含有5mg/mlBSA的0.1MNaHC03(pH8.6)封閉1h后，加入10μL的噬菌體12肽隨機(jī)肽庫進(jìn)行第一輪淘篩(panning)，共淘

8、篩三次，去除庫中與GST結(jié)合的噬菌體。再用ACE2A-GST融合蛋白(包被質(zhì)量濃度為100μg/ml)以同樣方法進(jìn)行篩選。經(jīng)過3輪篩選，可以明顯地看到特異結(jié)合的噬菌體得到富集。 三輪篩選后，隨機(jī)挑選20個噬菌斑，分別進(jìn)行噬菌體擴(kuò)增并純化噬菌體DNA進(jìn)行序列測定，經(jīng)過鑒定得到7個短肽序列將此氨基酸序列。與S蛋白的氨基酸序列經(jīng)BLAST軟件進(jìn)行比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中2個序列與S蛋白的受體結(jié)合區(qū)S318-510有較高的同源性。盡管該多