SARS冠狀病毒復(fù)制酶蛋白nsp8和nsp9受體蛋白的研究.pdf

1、本實驗從SARS冠狀病毒(BJ01株)基因組中經(jīng)RT-PCR克隆得到病毒復(fù)制酶蛋白nsp8全長594bp的基因序列，連接到載體pGEX-6p-1中，構(gòu)建原核表達(dá)載體pNSP8E，pNSP8E轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出可溶性的22kDa的nsp8蛋白。通過pull-down試驗，利用表達(dá)的GST-nsp8融合蛋白從A549細(xì)胞裂解液中釣取了nsp8的受體蛋白。肽質(zhì)量指紋圖譜分析表明，nsp8受體蛋白最可能為鋅

2、指蛋白zincfingerprotein324(ZNF324)。以ZNF324蛋白作為研究對象，從人肺腺癌細(xì)胞A549中，擴(kuò)增了該蛋白部分片段的基因序列，構(gòu)建了原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌中獲得表達(dá)。nsp8和ZNF324蛋白間的體外相互作用還需pull-down實驗進(jìn)一步證明。構(gòu)建nsp8的真核表達(dá)載體pNSP8，建立轉(zhuǎn)染nsp8的細(xì)胞系。以IgG-anti-nsp8(FITC)作為探針，進(jìn)行激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，nsp8蛋白分布在

3、細(xì)胞漿中；雙標(biāo)法檢測初步證實，在細(xì)胞內(nèi)部nsp8和ZNF324形成共同的發(fā)光點?！　”狙芯客ㄟ^pull-down實驗技術(shù)，從人肺腺癌細(xì)胞A549中釣取了SARS-CoV復(fù)制酶蛋白nsp8和nsp9的受體蛋白。對這些蛋白質(zhì)進(jìn)行分析表明，它們都是鋅指類蛋白；對nsp8和nsp9以及它們的受體蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的研究，將為深入了解nsp8和nsp9在病毒基因組的復(fù)制、亞基因組的轉(zhuǎn)錄以及病毒的裝配過程中起到的作用奠定基礎(chǔ)。在表達(dá)的受體蛋白中，B