豬δ冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp10抑制IFN--β產(chǎn)生的機(jī)制研究.pdf

1、豬δ冠狀病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)是一種新發(fā)現(xiàn)的豬腸道冠狀病毒，主要引起哺乳仔豬水樣腹瀉、嘔吐、脫水等。2014年，美國大規(guī)模爆發(fā)流行PDCoV。隨后，加拿大、韓國、泰國、越南、老撾等國家或地區(qū)也相繼報道了PDCoV的發(fā)生與流行，引起了全球養(yǎng)豬業(yè)的高度關(guān)注。
　　以前的研究證實(shí)PDCoV感染細(xì)胞后誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素(Interferon，IFN)的水平很低，而且抑制仙臺病毒(Sendai vi

2、rus，SeV)誘導(dǎo)的Ⅰ型IFN產(chǎn)生。但目前對PDCoV的哪些蛋白具有抑制Ⅰ型IFN產(chǎn)生的特性還不是很清楚。本研究發(fā)現(xiàn)PDCoV編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白nsp10具有抑制SeV誘導(dǎo)的Ⅰ型IFN產(chǎn)生的特性，并對其作用機(jī)制進(jìn)行了探索。主要研究結(jié)果如下:
　　1.PDCoV nsp10抑制SeV誘導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生
　　構(gòu)建了PDCoV nsp10的真核表達(dá)質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染HEK-293T或LLC-PK1細(xì)胞，通過檢測IFN-β啟動子雙熒光

3、素酶活性和mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)超表達(dá)nsp10顯著抑制SeV誘導(dǎo)的IFN-β啟動子激活和mRNA表達(dá)，證實(shí)PDCoV nsp10具有抑制IFN-β產(chǎn)生的特性。
　　2.PDCoV nsp10抑制SeV誘導(dǎo)的IRF3和NF-κB活化
　　NF-κB和IRF3是兩種協(xié)同激活I(lǐng)FN-β產(chǎn)生的重要轉(zhuǎn)錄因子。為了探討PDCoVnsp10是否抑制NF-κB和IRF3激活，將nsp10真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T或LLC-PK1細(xì)胞，通

4、過雙熒光素酶活性分析、Western blot、間接免疫熒光等分別檢測NF-κB和IRF3的啟動子活性、磷酸化和核轉(zhuǎn)運(yùn)。雙熒光素酶活性分析發(fā)現(xiàn)nsp10的表達(dá)顯著抑制SeV誘導(dǎo)的NF-κB和IRF3激活;Western blot證實(shí)nsp10對SeV誘導(dǎo)的p65(NF-κB亞基)和IRF3總蛋白水平?jīng)]有影響，但顯著降低p65和IRF3的磷酸化;間接免疫熒光結(jié)果也證實(shí)nsp10抑制SeV誘導(dǎo)的p65和IRF3入核。上述結(jié)果表明PDCoV

5、nsp10通過抑制NF-κB和IRF3的活化抑制IFN-β產(chǎn)生。
　　3.PDCoV nsp10抑制RIG-Ⅰ/MAD5介導(dǎo)的IFN信號通路
　　冠狀病毒主要通過RLR（RIG-Ⅰ-like receptor）介導(dǎo)天然免疫反應(yīng)。為了探討PDCoV nsp10是否抑制RLR途徑介導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生，將nsp10真核表達(dá)質(zhì)粒與RLR信號通路中的信號分子RIG-Ⅰ/RIG-IN、MDA5、IPS-1、TBK1/IKKε、IRF3/

6、IRF3-5D分別共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)nsp10抑制RIG-Ⅰ/RIG-IN、MDA5誘導(dǎo)的IFN-β啟動子激活，但不抑制IPS-1、TBK1/IKKε、IRF3/IRF3-5D誘導(dǎo)的IFN-β啟動子激活，推測nsp10可能靶向信號分子IPS-1或其上游的分子。但是，免疫共沉淀（CO-IP）實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示nsp10與RIG-Ⅰ、MDA5、TRIM25、TRIM65均不存在相互作用。因此，PDCoV nsp10到底靶向RLR途徑

7、中的哪個分子還有待進(jìn)一步研究。
　　4.PDCoV nsp10蛋白抑制IFN-β產(chǎn)生的關(guān)鍵區(qū)域分析
　　為了進(jìn)一步確定PDCoV nsp10抑制IFN-β產(chǎn)生的功能域，比較了不同冠狀病毒(SARS-CoV、PDCoV、PEDV、TGEV)nsp10的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)不同冠狀病毒nsp10的氨基酸序列相對保守。根據(jù)SARS-CoV nsp10的晶體結(jié)構(gòu)，對PDCoV nsp10進(jìn)行了同源模建，發(fā)現(xiàn)PDCoV nsp10的N端含

8、有一對反向平行的α螺旋，C端含有l(wèi)oop結(jié)構(gòu)，中間包含不規(guī)則的β折疊?；谕茨＝ńY(jié)構(gòu)，構(gòu)建了PDCoV nsp10不同區(qū)域的截短突變體(1-96aa、34-96aa、34-133aa)，發(fā)現(xiàn)34-96aa是抑制IFN-β產(chǎn)生的主要區(qū)域。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域內(nèi)含有一個鋅指結(jié)構(gòu)（C74-C77-H83-C90）。因此，針對鋅指結(jié)構(gòu)域構(gòu)建了4個單點(diǎn)突變的突變體(△N33△C37-C74A、△N33△C37-C77A、△N33△C37-H