診斷超聲聯(lián)合微泡促進(jìn)MSCs歸巢缺血心肌及改善心功能的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景： 心肌梗死(Myocardial infarction，MI)是由于冠狀動(dòng)脈循環(huán)改變引起冠狀血流和心肌需求之間不平衡而導(dǎo)致的心肌損害，是臨床上一種嚴(yán)重的缺血性心臟病(Ischcmicheart disease，IHD)。目前，治療冠心病的常用方法諸如藥物、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)及冠狀動(dòng)脈旁路移植等雖然能改善心肌缺血，卻不能使梗死區(qū)的血管再生。新近國內(nèi)外興起的一些干細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)治療缺血性心臟病，通過再生血管，為治療這類疾

2、病提供了新思路。 干細(xì)胞移植治療心肌梗死在大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床中的應(yīng)用已取得了令人鼓舞的療效，越來越多的證據(jù)表明，骨髓來源的干細(xì)胞能夠參與血管新生，改善心肌梗死后血流灌注及心臟功能。被用于移植的細(xì)胞種類很多，其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)目前被公認(rèn)最適合用于細(xì)胞移植治療，其易于分離提取，具有高度的擴(kuò)增潛能，有良好的基因穩(wěn)定性、組織相容性好、不涉及倫理道德問題等優(yōu)點(diǎn)，成為研究的熱點(diǎn)。

3、 但干細(xì)胞移植治療心肌缺血目前還存在一些問題，包括干細(xì)胞移植途徑的有創(chuàng)性、細(xì)胞移植效率低下及干細(xì)胞的定向歸巢能力欠佳等。如何尋找一種無創(chuàng)、移植效率更高及定向能力好的移植途徑與方法呢?研究顯示，脈沖式治療超聲聯(lián)合白蛋白微泡Optison能有效將經(jīng)靜脈移植的骨髓單個(gè)核細(xì)胞靶向運(yùn)送至心肌病動(dòng)物模型，心肌毛細(xì)血管密度、缺血心肌的血流灌注，VCAM-1，ICAM-1等黏附分子表達(dá)均得到了顯著提高，心臟功能也得到明顯改善，表明超聲介導(dǎo)的微泡破

4、壞能提高干細(xì)胞的靶向歸巢能力進(jìn)而更有效地實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞移植治療心臟病的效果。 研究目的： 1.探討診斷超聲聯(lián)合微泡促進(jìn)靜脈移植骨髓MSCs歸巢兔缺血心肌的可行性及其機(jī)制； 2.探討診斷超聲聯(lián)合微泡靜脈移植MSCs改善梗死后心肌血流灌注和心功能的有效性； 3.初步探討診斷超聲聯(lián)合微泡作用下無創(chuàng)移植MSCs改善心肌梗死后心功能的可能機(jī)制。 研究方法： 采用密度梯度離心聯(lián)合貼壁培養(yǎng)法進(jìn)行兔骨髓MSC

5、s的分離、純化及培養(yǎng)，檢測(cè)其生物學(xué)特性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記分子，成脂、成骨誘導(dǎo)分化進(jìn)行細(xì)胞鑒定。 冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎法建立兔心肌梗死模型，采用血清學(xué)、影像學(xué)及病理學(xué)方法評(píng)價(jià)模型的建立。 以熒光標(biāo)記物DAPI標(biāo)記MSCs，移植48h觀察標(biāo)記MSCs在靜脈移植MSCs組與超聲+微泡+MSCs組心肌、肺等臟器的熒光分布并進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)和統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。MSCs移植后4周透射電鏡觀察各組(PBS組、超聲+微泡組、靜脈移植

6、MSCs組與超聲+微泡+MSCs組)心肌缺血區(qū)血管超微結(jié)構(gòu)。免疫組織化學(xué)檢測(cè)心肌缺血區(qū)VCAM-1、SDF-1表達(dá)并行定量分析。 MSCs移植后4周HE染色檢測(cè)心肌缺血區(qū)的血管密度(Capillary density，CD)、免疫組織化學(xué)檢測(cè)CD34表達(dá)、western blot檢測(cè)血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelialgrowth factor，VEGF)水平，心肌聲學(xué)造影(Myocardial cont

7、rast echocardiography，MCE)評(píng)價(jià)心肌血流灌注。Masson染色檢測(cè)心肌膠原纖維形成，并計(jì)算各組膠原面積。免疫組織化學(xué)檢測(cè)各組心肌梗死區(qū)Bax蛋白的表達(dá)情況。通過M型超聲與雙平面Simpson法檢測(cè)左室收縮功能。 結(jié)果： 培養(yǎng)的MSCs貼壁生長，呈梭形為主；細(xì)胞表面高表達(dá)CD44，幾乎不表達(dá)CD45，不表達(dá)CD34。成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)后油紅O染色胞漿脂滴形成，成骨誘導(dǎo)后堿性磷酸酶染色見鈣顆粒，茜素紅S染色

8、鈣結(jié)節(jié)形成。 冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法建立MI模型后，MCE顯示左室前壁、前間隔呈灌注缺損，Masson染色左室前壁梗死區(qū)呈藍(lán)色染色。心肌梗死后兔左室收縮功能明顯降低。 熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)并比較靜脈移植MSCs組與超聲+微泡+MSCs組心肌梗死及周圍區(qū)DAPI陽性細(xì)胞數(shù)，分別為(147±19)個(gè)，(213±27)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在正常供血區(qū)心肌內(nèi)未見陽性細(xì)胞。透射電鏡顯示超聲+微泡+MSCs組與超聲+微泡組心肌

9、缺血區(qū)血管一側(cè)內(nèi)皮細(xì)胞間隔增大，血管通透性增加。免疫組織化學(xué)檢測(cè)SDF-1在各組中的心肌細(xì)胞胞膜與胞漿均有棕黃色陽性表達(dá)，超聲+微泡+MSCs組的灰度(188.45±2.83)與靜脈移植MSCs組(183.94±7.29)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，高于超聲+微泡組(175.46±8.13)和PBS組(170.52±6.04)(兩者P<0.05)。超聲+微泡+MSCs組的VCAM-1陽性細(xì)胞數(shù)量(77±44)個(gè)顯著高于靜脈移植M

10、SCs組(34±18)個(gè)，超聲+微泡組(12±3)個(gè)及PBS組(8±5)個(gè)(三者P<0.01)。 HE染色檢測(cè)超聲+微泡+MSCs組平均CD為(44±23)個(gè)，高于PBS組(19±10)個(gè)、超聲+微泡組(22±5)個(gè)及MSCs組(26±7)(三者P<0.01)。Masson染色檢測(cè)心肌膠原面積分別為PBS組(16.88±5.84)％、超聲+微泡組(14.77±2.95)％、MSCs組(12.05±4.83)％和超聲+微泡+MS

11、Cs組(8.97±3.5)％，超聲+微泡+MSCs組與前三組比較，膠原面積分別縮小約25.6％、40.1％及46.8％。免疫組織化學(xué)檢測(cè)超聲+微泡+MSCs組CD34陽性血管最多，分布密集，MSCs組較豐富，超聲+微泡組次之，PBS組的陽性血管最少。Bax蛋白陽性表達(dá)在PBS組最高，超聲+微泡組次之，MSCs組進(jìn)一步減少，超聲+微泡+MSCs組最少。M型超聲檢測(cè)超聲+微泡+MSCs組的FS(％)測(cè)值顯著高于PBS組和超聲+微泡組比較，P

12、<0.01，高于靜脈移植MSCs組，P<0.05。EF(％)比較，超聲+微泡+MSCs組較PBS組及超聲+微泡組顯著增高(P<0.01)，與靜脈移植MSCs組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。雙平面Simpson法EF值超聲+微泡+MSCs組高于PBS組(P<0.01)、超聲+微泡組(P<0.01)及靜脈移植MSCs組(P<0.05)。 結(jié)論： 1.成功實(shí)現(xiàn)兔骨髓源性MSCs的分離、純化及培養(yǎng)，密度梯度離心聯(lián)合貼壁

13、培養(yǎng)法是獲取、純化、擴(kuò)增MSCs簡(jiǎn)便、易行的方法。細(xì)胞生長曲線、細(xì)胞周期、透射電鏡檢測(cè)提示培養(yǎng)的MSCs呈低分化狀態(tài)，有較強(qiáng)的自我更新能力。流式細(xì)胞儀檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞高表達(dá)CD44，CD45呈陰性表達(dá)，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)CD34陰性，體外成脂、成骨誘導(dǎo)分化成功，判定所獲細(xì)胞為MSCs。 2.冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎法可建立穩(wěn)定的兔MI模型，血清學(xué)、影像學(xué)及病理學(xué)檢測(cè)可有效評(píng)價(jià)模型是否成功建立。 3.DAPI作為一種熒光劑，可有效示

14、蹤MSCs在體內(nèi)各臟器、各部位的分布，其方法簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便，可應(yīng)用于干細(xì)胞的標(biāo)記。 4.診斷超聲聯(lián)合脂膜微泡通過聲孔效應(yīng)可增加心肌梗死兔心肌血管通透性，為經(jīng)靜脈移植的MSCs歸巢到達(dá)缺血心肌提供了更多的通道與機(jī)會(huì)。微泡介導(dǎo)的超聲窄化效應(yīng)可刺激超聲輻照心肌缺血區(qū)小血管破裂及炎癥發(fā)生，促進(jìn)局部VCAM-1等黏附分子的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)移植的MSCs向心肌缺血區(qū)聚集與歸巢；同時(shí)，診斷超聲介導(dǎo)的微泡破壞效應(yīng)通過促進(jìn)VEGF生成與表達(dá)、刺激心

15、肌缺血區(qū)血管生成等途徑能更加有效改善心肌梗死后血流灌注。 5.MSCs移植后通過旁分泌效應(yīng)促進(jìn)血管生成因子VEGF、歸巢相關(guān)因子SDF-1、黏附分子VCAM-1的表達(dá)及抑制凋亡相關(guān)因子Bax表達(dá)，進(jìn)而有效增強(qiáng)MSCs的趨化、黏附、聚集及歸巢能力，通過促進(jìn)血管新生及抑制凋亡等機(jī)制來改善心肌梗死后心功能。 6.靜脈移植MSCs在超聲聯(lián)合微泡介導(dǎo)下通過抑制心肌梗死后膠原纖維形成，抑制心臟重構(gòu)來改善心功能。 7.本研究方