診斷超聲聯(lián)合微泡介導(dǎo)經(jīng)靜脈移植內(nèi)皮祖細(xì)胞治療心肌梗死的初步研究.pdf

1、背景和目的： 缺血性心臟病(Ischemic heart disease，IHD)是由于冠狀動(dòng)脈循環(huán)改變引起冠狀動(dòng)脈血流和心肌需求之間不平衡而導(dǎo)致的心肌損害，其中最常見的原因是冠心病，約占900/0。傳統(tǒng)的治療手段主要是重建血供，而不能修復(fù)損傷和壞死的心肌。近幾年興起的干細(xì)胞移植法通過再生血管與心肌組織，使人們看到了治療IHD的希望。 血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)是

2、指具有特異性歸巢于血管新生組織并能分化增殖為成熟內(nèi)皮細(xì)胞(Endothelial cells，ECs)的一群干/祖細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)EPCs參與出生后的內(nèi)皮修復(fù)和血管新生過程，提示其在IHD中重要的治療作用以及廣闊的臨床應(yīng)用前景。高增殖潛能和缺血區(qū)定向歸巢特性使EPCs成為缺血性心血管疾病治療的良好種子細(xì)胞。正常情況下，骨髓中EPCs處于休眠狀態(tài)，在損傷、缺血等因素作用下EPCs從骨髓釋放到外周血循環(huán)或經(jīng)人為移植到體內(nèi)，歸巢于特定器官或組織

3、，并在局部分化、增殖形成內(nèi)皮細(xì)胞和新生血管。研究顯示，缺血性心臟病患者血液循環(huán)中的EPCs數(shù)量下降了近50％，遷移能力受損。因此移植高增殖活性的EPCs是理想的細(xì)胞補(bǔ)充治療方法。 目前，EPCs治療IHD常用的移植途徑主要有經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射、心肌內(nèi)注射及經(jīng)心內(nèi)膜注射等途徑，以上途徑創(chuàng)傷性較大，因此極大地限制了EPCs在IHD中的應(yīng)用。此前研究認(rèn)為，只有通過介入及有創(chuàng)的方法方能將細(xì)胞準(zhǔn)確定位并高濃度聚集于缺血心肌，從而實(shí)現(xiàn)局部治

4、療。然而有研究報(bào)道，大部分心肌內(nèi)注射的骨髓源性基質(zhì)干細(xì)胞在4d后發(fā)生死亡，約60％經(jīng)冠脈內(nèi)注射的骨髓單核細(xì)胞(Marrow mononuclear cell，MMNC)被脾臟、肝臟攝取，心臟殘留的細(xì)胞數(shù)量僅約10％。那么如何解決EPCs移植有創(chuàng)且效率低下的問題呢？這是能否將這種血管新生及細(xì)胞再生治療方法廣泛應(yīng)用的一個(gè)關(guān)鍵問題。因此，急需尋找一種無創(chuàng)、有效且定向性好的EPCs移植方法。 最近Zen等利用脈沖式治療超聲聯(lián)合白蛋白微泡

5、(Microbubbles) Optison，將骨髓單核細(xì)胞經(jīng)外周靜脈輸入充血性心肌病(Congestive cardiomyopathy，CC)動(dòng)物模型，結(jié)果顯示超聲輻照+微泡+細(xì)胞移植組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心肌組織血管細(xì)胞粘附分子-I(VCAM-l)和細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)表達(dá)水平比單純靜脈注射細(xì)胞組更高，其靶向性粘附能力顯著高于單純靜脈移植細(xì)胞組，說明在超聲波作用下微泡破裂能提高細(xì)胞移植的靶向能力進(jìn)而可能更有效地實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的靶向傳輸

6、。 本研究嘗試?yán)贸暵?lián)合超聲造影劑(微泡)介導(dǎo)EPCs的無創(chuàng)、定向移植探索一種新方法，探討在該傳遞系統(tǒng)介導(dǎo)下能否有效促進(jìn)細(xì)胞靶向歸巢，初步探索其治療心肌梗死的可行性、有效性。 方法： 1.大鼠骨髓源性EPCs分離、誘導(dǎo)培養(yǎng)及鑒定： Ficoll密度梯度離心法分離SD大鼠骨髓源性單個(gè)核細(xì)胞，接種于包被纖維連接蛋白的培養(yǎng)板中，在添加了一定濃度的VEGF(50ng/mL)、bFGF(5ng/mL)和ECF(

7、10ng/mL)等生長因子的培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)；倒置顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞生長特性及形態(tài)學(xué)變化，繪制細(xì)胞生長曲線；流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞表面抗原CD34和VEGFR-2的表達(dá)；免疫熒光染色法檢測內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子標(biāo)志vWF以及攝取乙酰化低密度脂蛋白(acLDL)和結(jié)合荊豆凝集素-I(UEA-I)的特性。 2.大鼠心肌梗死(Myocardial infarction，MI)模型的建立與評(píng)價(jià)： 40只健康SD大鼠，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前

8、降支(Left anterior descending coronary artery，LAD)建立MI模型。建立模型之前和建模后1w，二維超聲與M型超聲觀察梗死區(qū)室壁厚度、搏動(dòng)幅度，M型超聲與左心室Tei指數(shù)檢測左心室功能。采用HE染色與Masson's染色法評(píng)價(jià)模型的建立。 3.診斷超聲聯(lián)合微泡經(jīng)靜脈移植EPCs治療MI的有效性評(píng)價(jià)： 將建模成功的42只模型大鼠隨機(jī)分為三組：單純EPCs組(n=15)、超聲輻照(Ul

9、trasound，US)+微泡(Microbubbles，MB)+EPCs組(n=15)、對(duì)照組(Normal sodium，NS)(n=12)。超聲條件設(shè)置：Vivid7超聲診斷儀，3S探頭，頻率設(shè)定為5MHz，機(jī)械指數(shù)(Mechanical index，MI)1.3，作用時(shí)間8 min，采用觸發(fā)條件，觸發(fā)問期為1s。模型建立1w后分組治療，對(duì)照組經(jīng)尾靜脈給予1ml NS，單純EPCs組直接將細(xì)胞(1×106個(gè)混懸于1mINS)經(jīng)尾靜

10、脈緩慢注入，US+MB+EPCs組則先經(jīng)尾靜脈注入本科自制的超聲造影劑“脂氟顯”(稀釋10倍后按1ml/kg劑量)，然后在Imin內(nèi)緩慢注入EPCs，注入微泡時(shí)啟動(dòng)超聲。細(xì)胞移植治療4w后，處死動(dòng)物、取材，采用HE染色，觀測并計(jì)數(shù)梗死區(qū)及周圍區(qū)毛細(xì)血管密度(Capillary density，CD)、心肌組織與血管通透性改變；采用Masson's染色測量計(jì)算心肌梗死面積；免疫組織化學(xué)檢測梗死區(qū)CD34表達(dá)。M型超聲心動(dòng)圖與Tei指數(shù)評(píng)價(jià)

11、各組左心室功能。 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用單因素方差分析和配對(duì)t檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)計(jì)算由SPSS13.0軟件完成，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1.大鼠骨髓源性EPCs培養(yǎng)及鑒定： 細(xì)胞培養(yǎng)3d后可以觀察到細(xì)胞增多增大，呈紡錘形或短梭形細(xì)胞，逐漸伸出偽足樣突起。5d后細(xì)胞較前明顯增多，7d后細(xì)胞數(shù)顯著增加，呈內(nèi)皮細(xì)胞特異性的條索樣結(jié)構(gòu)，呈集落樣生長。隨著培

12、養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞相互融合，首尾相連呈“鋪路石”狀。流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞表面抗原CD34、VEGFR-2表達(dá)率分別為86.02％和81.37％；免疫熒光染色檢測顯示所培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)vWF，并具有攝取acLDL和結(jié)合UEA-I的能力。 2.大鼠MI模型的建立與評(píng)價(jià)： 成功建立MI模型29只，其余11只大鼠分別死于麻醉意外、呼吸衰竭和心力衰竭等原因。建模成功大鼠二維超聲檢查可以看到其左心室前壁變薄、運(yùn)動(dòng)減弱或消失；超聲檢測建

13、模前后大鼠左心功能，差異有十分顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。H染色顯示大量心肌細(xì)胞壞死，疤痕形成；Masson's染色顯示左心室前壁心肌梗死區(qū)被膠原纖維取代，染色呈藍(lán)色。 3.診斷超聲聯(lián)合微泡經(jīng)靜脈移植EPCs治療MI的有效性評(píng)價(jià)： HE染色計(jì)數(shù)心肌內(nèi)CD: US+MB+EPCs組CD為(25.3+12.2)個(gè)/視野，明顯高于對(duì)照組(12.6±4.5)個(gè)/視野和單純EPCs組(19.2±6.2)個(gè)/視野(兩者P<0

14、.01)。 大鼠心肌梗死面積的測定結(jié)果顯示對(duì)照組的梗死面積為(41.9±4.3)％，EPCs組梗死面積為(36.7±3.8)％，而US+MB+EPCs組梗死面積為(25.3±4.5)％，明顯低于前兩者(兩者P<0.01)。 免疫組織化學(xué)檢測采用CD34顯示各組血管，陽性呈棕黃色。US+MB+EPCs組陽性血管最多，分布密集，單純EPCs組也可見較豐富的血管分布，而對(duì)照組的陽性血管最少。 US+MB+EPCs組的

15、左心室收縮功能FS測值(50.27±5.98)％，高于對(duì)照組(30.24±9.35)％(P<0.01)和單純EPCs組(41.60±8.0)％(P<0.05)。EF測值比較，US+MB+EPCs組(85.9±2.18)％高于對(duì)照組(61.94±14.06)％(P<0.01)，高于單純EPCs組(76.84±9.45)％(P<0.05)。左心室Tei指數(shù)檢測：US+MB+EPCs組(0.57±0.10)分別低于單純EPCs組(0.66±0

16、.08)(P<0.05)和對(duì)照組(0.83±0.13)(P<0.01)。 結(jié)論： 1.大鼠骨髓中單個(gè)核細(xì)胞可誘導(dǎo)分化為EPCs。VEGF、bFGF和EGF可促進(jìn)EPCs的增殖分化。 2.通過結(jié)扎大鼠LAD成功建立了穩(wěn)定的MI模型。左心室Tei指數(shù)可作為評(píng)價(jià)心肌梗死后心功能的指標(biāo)。 3.診斷超聲聯(lián)合微泡介導(dǎo)經(jīng)靜脈移植EPCs可改善Ml大鼠心功能。其機(jī)制可能與超聲空化效應(yīng)與機(jī)械效應(yīng)通過增加局部血管通透性促使E