超聲輻照破壞微泡對心肌微環(huán)境的影響及促犬MSCs歸巢缺血心肌實驗研究.pdf

1、本文分析了超聲輻照破壞微泡對心肌微環(huán)境的影響，對促犬MSCs歸巢缺血心肌進行了研究。本研究分為四個部分：
　　 第一部分：
　　 目的：探討出一種可靠、純度高的犬骨髓間充質(zhì)干細胞(bonemarrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)體外提取分離、純化、培養(yǎng)和鑒定的方法。
　　 方法：采用骨髓穿刺、Percoll密度梯度離心法分離出犬骨髓單個核細胞,結(jié)合貼壁培養(yǎng)法獲得純度高的骨髓間充質(zhì)

2、干細胞,應用細胞免疫化學和流式細胞儀對BMMSCs表面標記蛋白進行細胞鑒定和周期測定。
　　 結(jié)果：分離出的細胞檢測顯示CD29、CD44均呈陽性表達,CD31、CD34、CD45和vWF的表達為陰性；88.88％的細胞處在G0/G0期；2w內(nèi)經(jīng)3代培養(yǎng)即可擴增到107細胞數(shù)量級。
　　 結(jié)論：采用密度為1.073g/ml Percoll分離液梯度離心,并用貼壁純化的方法可獲得純度較高的BMMSCs。2w內(nèi)經(jīng)3代培養(yǎng)即可

3、擴增到107細胞數(shù)量級,符合構(gòu)建組織工程種子細胞的要求。
　　 第二部分：
　　 目的：探討不同強度的超聲輻照破壞微泡對犬心肌組織的生物學效應。
　　 方法：9只健康成年雜種犬隨機分成3組,每組3只。采用頻率為1 MHz,強度不同的超聲輻照犬心肌組織,輻照時間為5 min,同時靜脈輸入2 ml(濃度為2×108個/ml)微泡造影劑。輻照完畢后即刻處死動物,取局部心肌組織,進行HE染色和透射電鏡觀察心肌細胞及毛細血

4、管內(nèi)皮細胞等細胞超微結(jié)構(gòu)改變。
　　 結(jié)果：0.5W/cm2超聲破壞微泡后心肌組織水腫,無出血；1.0W/cm2超聲破壞微泡后心肌組織輕微出血和少量炎癥細胞侵潤；2.0W/cm2超破壞微泡后心肌組織明顯出血和一定程度的炎癥細胞侵潤。
　　 結(jié)論：不同強度超聲破壞微泡造影劑能使犬心肌組織產(chǎn)生不同程度的生物學效應,發(fā)現(xiàn)超聲強度在1.0～2.0 W/cm2時能使心肌損傷程度在不重的情況下引起一定程度的炎癥反應。
　　

5、第三部分：
　　 目的：探討超聲輻照破壞微泡對心肌梗死模型犬局部心肌微環(huán)境的影響情況。
　　 方法：10只心肌梗死模型犬隨機分成兩組(實驗組與對照組),每組5只。在心肌梗死模型建立1w后,實驗組用聲強為1.0 W/cm2,頻率為1 MHz的脈沖超聲經(jīng)胸輻照左室前壁,輻照10 min,同時靜脈輸注2 ml(濃度2×108個/m1)微泡造影劑,每2-3 d輻照一次,一共處理3次；對照組不經(jīng)任何處理。在心肌梗死模型建立14-1

6、7 d后處死所有動物,在心肌梗死邊緣區(qū)取局部心肌組織,通過Western blot、定量實時PCR及免疫組織化學檢測血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelialgrowth factor VEGF),基質(zhì)細胞衍生因子1(Stromal cell-derivedfactor-1,SDF-1),血管內(nèi)皮細胞粘附因子1(vascular cell adheremolecular-1,VCAM-1),白介素1β(Interleuk

7、in1,IL-1β)的表達水平,觀察超聲輻照破壞微泡對心肌微環(huán)境的影響。
　　 結(jié)果：Western blot和免疫組織化學檢查顯示實驗組心肌分泌VEGF,SDF-1,VCAM-1,IL-1β比對照組多,定量實時PCR檢查到實驗組內(nèi)VEGF,SDF-1,VCAM-1,IL-1β表達明顯比對照組多(P<0.05)。
　　 結(jié)論：超聲輻照破壞微泡可以引起心肌內(nèi)源性生物活性物質(zhì)的分泌,能促進VEGF,SDF-1,VCAM-1和

8、IL-1β分泌,改變了局部心肌微環(huán)境。
　　 第四部分：
　　 目的：觀察超聲輻照微泡對犬骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymalstem cells,MSCs)歸巢到犬心肌缺血部位的作用。
　　 方法：10只心肌梗死模型犬隨機分成兩組(實驗組與對照組),每組5只。在心肌梗死模型建立1w后,實驗組用聲強為1.0 W/cm2,頻率為1 MHz的脈沖超聲經(jīng)胸輻照心肌,輻照10 min,同時靜脈輸注2ml(濃度為2×1

9、08個/ml)微泡造影劑,每2-3 d處理一次,一共處理3次；對照組不經(jīng)任何處理。在心梗后2w,實驗組經(jīng)冠狀動脈輸注5ml(濃度1.35×106個/ml),DAPI標記的MSCs。對照組輸注等量的干細胞。移植5 d后處死動物,取心肌梗死邊緣區(qū)組織,用激光共聚焦顯微鏡觀察MSCs在心肌缺血區(qū)的分布情況。
　　 結(jié)果：通過激光共聚焦顯微鏡檢測到實驗組MSCs(66.8±5.03/HPF),明顯比對照組MSCs(14.6±3.76/H