超聲靶向破壞微泡增強microRNA-21轉染豬心肌組織的研究.pdf

1、目的：超聲靶向破壞微泡(Ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD)作為一項高效、安全、具有靶向性的非病毒基因傳輸技術，已成功應用于體外及小動物研究。然而，UTMD介導外源基因轉染大動物心肌組織的可行性、轉染條件及其效果如何，目前國內外少有研究報道。本研究擬探討UTMD介導microRNA-21(miR-21)轉染豬心肌的可行性并進一步優(yōu)化其轉染參數(shù)。
　　方法：構建miR-2

2、1真核表達質粒并體外轉染血管內皮細胞以檢測其表達活性。我們首先優(yōu)化UTMD介導miR-21轉染豬心肌組織的適宜輻照強度。經耳緣靜脈給予載基因超聲微泡(miR-21/MB)，同時以不同超聲強度(1W/cm2，2W/cm2，3W/cm2)輻照左室前壁直至微泡消失。待研究得出適宜輻照強度后進一步探討UTMD介導miR-21經靜脈與冠脈轉染豬心肌組織的效果。分別經耳緣靜脈及冠脈左前降支（LAD）給予miR-21/MB，同時經胸進行超聲輻照;以單

3、純PBS注射組（空白對照組）、單純靜脈或冠脈注射miR-21/MB而不予超聲輻照組作為對照。采用心臟超聲評價心功能，以電化學發(fā)光法(ELC)檢測血清肌鈣蛋白Ⅰ(cTnⅠ)水平;術后4天取左室前壁心肌組織，冰凍切片熒光顯微鏡下觀察心肌組織增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的表達情況，石蠟切片HE染色觀察心肌組織形態(tài)學改變，分別采用實時熒光定量PCR(FQ-PCR)和蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測心肌組織miR-21及其靶基因P

4、DCD4的表達水平。
　　結果：miR-21重組質粒構建成功并可在真核細胞內有效表達。應用心臟超聲在術前及術后不同時間點(3h，12h，24h，4d)檢測心功能，結果發(fā)現(xiàn)不同強度超聲輻照(1W/cm2，2W/cm2，3W/cm2)各組心功能指標(LVEF, FS，CO及LVEDd)均未見明顯動態(tài)改變，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。血清cTnⅠ動態(tài)檢測結果顯示，3W/cm2超聲輻照組血清cTnⅠ水平呈動態(tài)改變，術后3h開始升高，

5、12h達高峰，此后逐漸下降并于術后4d回到基線水平（P＜0.05）。1W/cm2及2W/cm2超聲輻照組術后不同時間點血清cTnⅠ水平均未見明顯改變，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。HE染色結果顯示不同強度超聲輻照各組心肌組織形態(tài)保持完好，未見心肌壞死、出血以及炎癥反應等。FQ-PCR結果表明與1W/cm2、3W/cm2超聲輻照組相比，2W/cm2超聲輻照心肌組織miR-21表達水平較高(P＜0.05)。Western blot結果顯

6、示與1W/cm2超聲輻照組相比，2W/cm2、3W/cm2超聲輻照均可顯著抑制心肌組織PDCD4表達，尤以2W/cm2超聲輻照組明顯(P＜0.05)。
　　UTMD介導miR-21經靜脈與冠脈轉染豬心肌，冰凍切片熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)空白對照組心肌組織未見EGFP表達;單純靜脈或冠脈給予miR-21/MB，EGFP表達主要位于心內膜下及血管周圍;聯(lián)合超聲輻照后，心肌組織可見明顯EGFP表達。FQ-PCR結果顯示與空白對照組相比，單純

7、靜脈給予miR-21/MB并不能提高心肌組織miR-21表達（P＞0.05），單純冠脈給予miR-21/MB雖可提高心肌組織miR-21表達，但轉染效率仍然較低(P＜0.05)。與單純給予miR-21/MB相比，不論靜脈抑或冠脈內給藥，UTMD均可顯著提高心肌組織miR-21表達(P＜0.05)，其中冠脈給藥組稍高于靜脈給藥組，盡管其給藥劑量為靜脈組的一半(P＜0.05)。Western blot結果表明，單純靜脈給予miR-21/MB

8、不能抑制PDCD4表達(P＞0.05);單純冠脈給予miR-21/MB，心肌組織PDCD4表達稍有下降(P＜0.05);而UTMD介導miR-21經靜脈或冠脈轉染豬心肌可顯著抑制PDCD4表達(P＜0.05)，尤以冠脈給藥組明顯(P＜0.05)。
　　結論：以強度2W/cm2，頻率1MHz，占空比50％，脈沖輻照20min，不論經靜脈抑或冠脈途徑給藥，UTMD均可顯著增強外源基因轉染大動物心肌組織。考慮到臨床應用的簡便性、較小的侵