超聲微泡提高SelS基因靶向轉(zhuǎn)染2型糖尿病大鼠胸主動脈效率的研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　 2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)的主要死因是其合并的大血管并發(fā)癥，動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是大血管病變的病理基礎(chǔ)，氧化應(yīng)激反應(yīng)是觸發(fā)AS的主要原因之一。硒蛋白S(Selenoprotein S，SelS)可參與氧自由基的清除，抵抗氧化應(yīng)激導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。本研究旨在利用微泡聲學(xué)造影劑(Microbubble contrast a

2、gent，MCA)與超聲照射(Ultrasound exposure，UE)聯(lián)合應(yīng)用(MCA-UE)介導(dǎo)SelS基因轉(zhuǎn)染T2DM-AS大鼠模型;觀察SelS在T2DM-AS大鼠模型胸主動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)情況;以及血清總膽固醇(TC)、總甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、血清淀粉樣蛋白A(SAA)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、一氧化氮(NO)、血漿內(nèi)皮素-1(ET-1)含量的變化;探討基因轉(zhuǎn)染后內(nèi)皮細(xì)胞SelS表達(dá)豐度與基

3、因轉(zhuǎn)染劑量及時間的關(guān)系，為深入研究SelS的功能提供實驗依據(jù)，并探求防治T2DM及大血管病變的研究新策略。
　　 方法:
　　 1.微泡復(fù)合體的制備:通過抗生物素蛋白-生物素多級橋接化學(xué)法將抗生物素蛋白鏈菌素及生物素化VCAM-1單克隆抗體逐步結(jié)合到微泡外殼，制備攜帶目的基因SelS的靶向超聲微泡復(fù)合體。
　　 2.購買8周齡健康雄性SD大鼠(體重180～200g)140只，隨機(jī)分為正常對照組（10只，普通飼料喂

4、養(yǎng)，NC組）、T2DM-高脂喂養(yǎng)轉(zhuǎn)染組（120只，TR組）、T2DM-高脂喂養(yǎng)未轉(zhuǎn)染組（10只，NTR組）;其中TR組按照不同的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒劑量（50μg/kg、100μg/kg、200μg/kg）、轉(zhuǎn)染至處死大鼠的天數(shù)不同（1天、3天、5天、7天）分為12個亞組（每個亞組10只），分別設(shè)為TR50-1、TR50-3、TR50-5、TR50-7、TR100-1、TR100-3、TR100-5、TR100-7、TR200-1、TR200-3、

5、 TR200-5、TR200-7組。
　　 3.高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周后，腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)30mg/kg制備2型糖尿病模型，其后應(yīng)用維生素D3注射液60萬U/kg腹腔注射（總劑量平均分3次注射，糖尿病成模后前3周每周1次），高糖高脂飼料喂養(yǎng)共16周。25周齡時將TR組進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染處理，將制備的靶向超聲微泡復(fù)合體尾靜脈注射(NC組及NTR組作為陰性對照，尾靜脈注射等體積生理鹽水及MMV混合液體)，基因轉(zhuǎn)染治療儀輻照胸主動

6、脈體表投影區(qū)。TR組于轉(zhuǎn)染后第1天、3天、5天及7天(NC組及NTR組于轉(zhuǎn)染后第1天)分別處死，留取血清及胸主動脈，測定血脂、血清SAA、CRP、NO及血漿ET-1含量;提取大鼠胸主動脈總RNA及總蛋白，以Real-timePCR方法檢測SelSmRNA水平的表達(dá)，Western blot方法檢測SelS蛋白水平的表達(dá);將大鼠胸主動脈組織0.5cm固定于10％中性福爾馬林溶液中，行常規(guī)HE染色評價T2DM-AS成模情況。
　　

7、結(jié)果:
　　 1.成功制備微泡復(fù)合體，靜置狀態(tài)下上層為白色混濁狀，下層為較清液體。普通顯微鏡下可見呈圓形泡狀結(jié)構(gòu)，應(yīng)用熒光顯微鏡對微泡復(fù)合體進(jìn)行定性鑒定，在圓形微泡周圍可見綠色熒光。
　　 2.成功建立T2DM-AS模型: NTR組體重、血糖均高于NC組（P＜0.05）。鏡下可見NC組胸主動脈內(nèi)皮光滑，無纖維增生及脂紋形成;NTR及TR組組胸主動脈的平滑肌細(xì)胞核變大、變圓，細(xì)胞變短，向內(nèi)皮遷移，內(nèi)皮細(xì)胞聚集變形，形成纖維

8、帽;內(nèi)膜可見針尖大小裂隙，中膜層結(jié)構(gòu)疏松，彈力纖維增生，成玻璃樣變，形成脂紋。上述病理改變提示，NTR組及TR組大鼠已形成動脈粥樣硬化。
　　 3.SelS表達(dá)豐度及時效研究結(jié)果:各組大鼠胸主動脈均有SelS的mRNA表達(dá)，TR50-5組、TR100-5組、TR200-3組是對應(yīng)各轉(zhuǎn)染劑量組表達(dá)量最高的三組，其中TR50-5＞TR100-5組＞TR200-3組;TR100-5組SelS蛋白表達(dá)量較NC組及NTR組上調(diào)（P＜0.0

9、5），其余TR組的SelS蛋白表達(dá)量與NC組及NTR組相比均無統(tǒng)計學(xué)意義。TR100-5組SelS mRNA和蛋白的表達(dá)豐度最高。
　　 4.血脂、血清SAA、CRP、NO及血漿ET-1的測定結(jié)果: NTR組及TR100-5組大鼠的血脂(TC、TG、LDL-C)及血清NO較NC組均明顯升高（P＜0.05），但NTR組與TR100-5組大鼠之間的血脂、NO水平無明顯差異（P＞0.05）。NTR組及TR100-5組大鼠血清SAA、C

10、RP及血漿ET-1的水平均較NC組明顯升高(P＜0.05)，經(jīng)單次尾靜脈注射SMMV聯(lián)合超聲輻照轉(zhuǎn)染SelS后，可以明顯降低大鼠血清SAA、CRP及血漿ET-1的水平（TR100-5組較NTR組降低，P＜0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1.超聲微泡可以提高SelS基因靶向轉(zhuǎn)染2型糖尿病大鼠胸主動脈的效率，其作用與轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的劑量及時間有關(guān)。當(dāng)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒劑量為100μg/kg，轉(zhuǎn)染第5天時體內(nèi)SelS表達(dá)量達(dá)最佳，時效為1周